秦 雪，張曉東，張國林，郭麗娜，張春香，任有蛇，岳文斌

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

綿羊Txl－2基因CDS區(qū)克隆及其生物信息學(xué)分析

秦 雪，張曉東，張國林，郭麗娜，張春香，任有蛇，岳文斌*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

本研究以綿羊睪丸組織為材料，利用RT－PCR技術(shù)獲得綿羊硫氧還蛋白類蛋白2(Thioredoxin like protein 2，Txl－2)基因的CDS區(qū)序列，并對其進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，克隆得到的綿羊Txl－2基因CDS區(qū)為795 bp，編碼264個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，Txl－2編碼的蛋白無跨膜區(qū)、信號肽和N－糖基化位點，存在多個磷酸化位點;預(yù)測出了Txl－2蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu);Clustel W方法對比綿羊Txl－2與綿羊、山羊預(yù)測序列同源性最高。

Txl－2;綿羊;CDS區(qū)克隆;生物信息學(xué)分析

硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是生物體中普遍存在的一種小分子蛋白，是生物體調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的一種重要蛋白質(zhì)，廣泛存在于低等生物到人的組織中。硫氧還蛋白系統(tǒng)由三部分組成:Trx、NADPH和TrxR，即硫氧還蛋白、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和硫氧還蛋白還原酶。硫氧還蛋白在大腸桿菌中首次被發(fā)現(xiàn)，在隨后的研究中人們發(fā)現(xiàn)其存在于絕大多數(shù)的真核及原核生物中［1］。硫氧還蛋白在進化上相當(dāng)保守，存在一個二硫化物活性中心Cys－Gly－Pro－Cys(CGPC)，組成了具有氧化還原活性功能的結(jié)構(gòu)基序［2］，發(fā)揮其氧化還原作用。硫氧還蛋白最主要的功能就是二硫化物還原酶活性，除此之外，還是細胞凋亡、細胞生長和分化的調(diào)控因子;也可作為DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［3］。Txl－2(Thioredoxin like protein 2)是硫氧還蛋白家族的新成員，是介于在組織中廣泛表達和睪丸/精子特異性表達的Trx蛋白［4］。Sadek等［5］研究了 Txl－2 在人上的定位和表達情況，結(jié)果表明，Txl－2的開放閱讀框由330個氨基酸組成的，N端是典型的硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，C端則屬于核酸蛋白激酶(NDP)的結(jié)構(gòu)域。研究中還發(fā)現(xiàn)了外顯子5缺失的△5Txl－2。Txl－2在睪丸和肺中有高表達外，在其它組織中也有低水平的表達。Txl－2主要定位于肺泡上皮的纖毛組織和由微管組成的精子尾部軸絲，可能與維持微管的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)，但其確切的生物學(xué)功能有待進一步研究。但是在其它哺乳動物中Txl－2研究較少。由于Txl－2在精子發(fā)生成熟以及受精過程中可能發(fā)揮重要作用，因而是發(fā)展新型男用免疫避孕抑制劑的一種潛在的靶分子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

本試驗選用雜種公羔(杜泊×小尾寒羊)的睪丸組織采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院牧站羊場。

1.1.2 主要試劑

pMD－18T載體、Ecoil JM109、RNAiso Plus、Taq 酶、dNTP、Prime ScriptTM RT Master均 購 自 TaKaRa公 司;DEPC、AMP+、X－Gal、酵母提取物均購自Sigma公司;感受態(tài)細胞、DNA瓊脂糖膠回收試劑盒均購自北京康為試劑有限公司;其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

以GeneBank中已公布的綿羊預(yù)測序列(登錄號:XM_004003307)為模版，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，引物序列為:Txl－2 F:GCCATGGGCAGCAAGAAAAAGG AAG;Txl－2 R:CTTCAGCTTGTGGCCTCAC CCTGG。

1.2.2 睪丸總RNA提取

綿羊睪丸組織經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉，移入EP管中，在樣品中加入1 ml RNAiso Plus試劑，漩渦混勻，按操作說明提取總RNA，核酸蛋白分析儀測定其濃度與純度。

1.2.3 RT－PCR擴增

反轉(zhuǎn)錄體系:5×Prime ScriptTM RT Master Mix 2 μl，總 RNA 4.5 μl，無 RNA 酶H2O 3.5 μl。反 應(yīng) 條 件:37 ℃ 15 min;85℃5s;4℃延伸;PCR擴增體系:10×PCR 緩沖液 1.5 μl，NTP 模板 2 μl，Taq 酶0.5 μl，cDNA 模 版 1 μl，上 下 游 引 物 各0.6 μl，雙 蒸 水 8.8 μl。PCR 擴 增 程 序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán);72℃延伸8 min。

1.2.4 克隆測序

采用TaKaRa公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒將PCR瓊脂糖凝膠檢測的目的片段回收純化，在DNA連接酶的作用下，與載體過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，并在含氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，經(jīng)藍白斑篩選，挑取白色的單菌落在含AMP+的LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，將所得菌液進行擴增，分裝送至公司測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析方法如下:蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析 http://web．expasy．org/protparam/;蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析 http://www．cbs．dtu．dk/services/TMHMM/;蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測http://www．cbs．dtu．dk/services/SignalP/;蛋白質(zhì)N－糖基化位點預(yù)測http://www．cbs．dtu．dk/services/NetNGlyc/;蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測 http://www．cbs．dtu．dk/services/NetPhos/;蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測DNAStar軟件;蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測http://www．rcsb．org/pdb/;序列比對及同源性分析采用DNA MAN、DNA Star軟件中EditSeq程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT－PCR擴增

以綿羊睪丸總RNA為模版，通過RTPCR，產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約800 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

2.2 Txl－2序列分析

綿羊Txl－2基因CDS區(qū)為795 bp，共編碼264個氨基酸。

2.3 Txl－2的生物信息學(xué)分析

2.3.1 Txl－2蛋白基本性質(zhì)分析

圖1 RT－PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖2 綿羊Txl－2編碼區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列

根據(jù)在線網(wǎng)站的ProtParam程序的分析結(jié)果，目的蛋白分子質(zhì)量約為29KD，pI為4.70，不穩(wěn)定系數(shù)為44.50，大于40，為不穩(wěn)定蛋白。編碼264個氨基酸，其中帶負電荷的氨基酸(Asp+Glu)為56個，帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)為31個?？偲骄杷笖?shù)為－0.610。

2.3.2 Txl－2蛋白跨膜區(qū)、信號肽、磷酸化位點等理化功能預(yù)測

通過TMHMM、SignalP服務(wù)器預(yù)測綿羊Txl－2氨基酸無跨膜結(jié)構(gòu)，也沒有信號肽位點(圖3A、B);NetOGlyo服務(wù)器預(yù)測Txl－2氨基酸序列無 N糖基化位點(圖3C);NetPhos預(yù)測Txl－2氨基酸包括12個磷酸化位點，其中包括7個絲氨酸位點和5個蘇氨酸位點(圖3D)。

圖3 綿羊Txl－2跨膜結(jié)構(gòu)(A)、信號肽位點(B)、N糖基化位點(C)和磷酸化位點(D)

2.3.3 Txl－2蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用DNA Star中的Protean程序分析Txl－2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。應(yīng)用 Carnier－Robson方法預(yù)測目的蛋白的α－螺旋、β－折疊、Turn－轉(zhuǎn)角和Coil卷曲(見圖4)，所占比例依次為78.8%、2.16%、9.71%和9.33%。采用Swiss Model服務(wù)器預(yù)測綿羊Txl－2蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)模型見圖5。

圖4 綿羊Txl－2蛋白二級結(jié)構(gòu)分析圖

圖5 綿羊Txl－2蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.4 氨基酸同源比對

綿羊Txl－2氨基酸序列與人、小鼠序列及大鼠、牛、山羊、綿羊、豬、馬、大猩猩預(yù)測序列進行Clustal W多重比對結(jié)果見圖6。由圖6可知，綿羊Txl－2與山羊、綿羊(預(yù)測序列)同源性最高，親緣關(guān)系最近，首先聚在一起;與豬、馬(預(yù)測序列)關(guān)系較近，與其他物種遺傳距離逐漸增大。

圖6 綿羊Txl－2氨基酸序列多重比對及分子系統(tǒng)進化樹

3 討論

所有的生物體都有至少一種硫氧還蛋白體系，隨著真核生物的進化復(fù)雜性的增加，相應(yīng)地硫氧還蛋白體系的數(shù)量也有所增加。哺乳動物細胞有至少兩種硫氧還蛋白體系，分別定位在細胞質(zhì)中和線粒體中［6］。在多種氧化還原酶類中，硫氧還蛋白及相關(guān)蛋白是許多生理反應(yīng)和病理反應(yīng)的最重要的酶類之一［7］。本研究從綿羊睪丸組織中克隆得到的Txl－2基因CDS區(qū)由264個氨基酸組成，分子量約為29KD，蛋白結(jié)構(gòu)分析其具有典型的硫氧還蛋白家族的結(jié)構(gòu)基序。通過綿羊Txl－2核酸序列與其他動物比對，綿羊與山羊、豬、馬親緣關(guān)系最近，這表明哺乳類的家畜都具有相似的進化速度。

預(yù)測綿羊Txl－2氨基酸序列化學(xué)修飾位點，Txl－2蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，沒有N－糖基化位點，表明Txl－2是一個核蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化或轉(zhuǎn)錄調(diào)控。大量研究表明，硫氧還蛋白系統(tǒng)在細胞增殖和生存過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Muller等［8］報道，當(dāng)谷胱甘肽還原酶缺失時，氧化的谷胱甘肽增加，在這種情況下細胞需要Trx才能正常生長。Matsui等［9］報道，Trx不僅在正常發(fā)育過程中對細胞的分化起調(diào)節(jié)作用，并且可以作為生長因子刺激T淋巴細胞的增殖。Nakamura等［10］研究表明，血漿中 Trx含量是代表機體氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)，同時發(fā)揮保護細胞以及抗炎癥因子的作用。對Txl－2蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測有助于判斷Txl－2活性中心位置和功能區(qū)域，也是預(yù)測Txl－2更高級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。Txl－2蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α－螺旋為主，較易形成復(fù)合物發(fā)揮作用，并能牢固地維持蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。

通過生物信息學(xué)分析可以認識代謝、發(fā)育、分化、進化等規(guī)律。本研究成功從綿羊睪丸組織中克隆出Txl－2的完整 CDS區(qū)，并首次運用生物信息學(xué)方法對綿羊Txl－2編碼的蛋白進行功能預(yù)測，為進一步研究Txl－2的表達和功能奠定基礎(chǔ)，對深入了解Txl－2基因結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性具有重要意義。

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Clonging and Bioinformatics Prediction of Thioredoxin like protein 2 Coding Sequence in Sheep

QIN Xue，ZHANG Xiao-dong，ZHANG Gao-lin，GUO Li-na，ZHANG Chun-xiang，REN You-she，YUE Wen-bin

(College of Animal Science and Technology Shanxi Agricultral University，TaiGu 030801)

RT－PCR was used to clone full length of Thioredoxin like protein 2 CDS from sheep testis and bioinformatics analysis was performed．The results showed that Txl－2 CDS was 795 bp and encoded a protein of 264 amino acids．It had no transmembrane region，signal peptide and N －glycosylation sites of Txl－2 protein，while there were several phosphpryiation sites in the sequence．The Secondary structure and tertiary structure of Txl－2 protein were also predicted．The Clustel W alignment results showed that Txl－2 had a close relationship with sheep and goat predicated sequence．

Thioredoxin like protein 2;sheep;CDS cloning;bioinformatics analysis

S826;Q81

A

1005－2739(2014)02－0003－05

2014－01－07

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(NYCYTX－39)資助。

秦雪(1988－)，女，山西長治人，在讀碩士研究生，研究方向動物繁殖技術(shù)調(diào)控。

岳文斌(1952－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動物繁殖調(diào)控方面研究。