王洪志，喬曉莉，劉 勇，李婉晴

(天津市南開醫(yī)院，天津300100)

實驗研究

兩種溶劑提取大黃蒽醌類成分的變化*

王洪志，喬曉莉，劉 勇，李婉晴

(天津市南開醫(yī)院，天津300100)

目的:考查以熱水(100℃，即水煎煮后下)和乙醇為提取溶劑對大黃蒽醌類成分提取的影響。方法:采用高效液相色譜法，以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種成分含量之和為指標(biāo)，考查不同時間熱水和不同濃度乙醇煎煮大黃蒽醌類成分的變化。結(jié)果:以熱水提取時，煎煮25 min大黃游離型蒽醌和總蒽醌含量最高;乙醇提取時，50%乙醇煎煮35 min總蒽醌和結(jié)合型蒽醌含量最高。結(jié)論:大黃熱水煎煮以25 min為宜，而醇提以50%乙醇提取35 min為宜，總蒽醌轉(zhuǎn)移率分別達(dá)到38%和48%。

大黃，蒽醌類成分，水提，醇提

大黃為蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim ex Balf)或藥用大黃(Rheum officinale Baill)的干燥根及根莖［1］，主要有效成分為幾種葡萄糖苷和苷元，含量約3%～5%，苷元主要是蒽醌類衍生物，包括大黃酚(chrysophanol或chrysophanic acid，C15H10O4)、大黃素(emodin或rheum emodin，C15H10O5)、蘆薈大黃素(Aloe－emodin，C15H10O5)、大黃酸(Rhein，C15H8O6)和大黃素甲醚(physcion或parietin、rheochrysidin，C16H12O5)［2，3］。其中游離蒽醌難溶或不溶于水，可溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，而結(jié)合蒽醌及苷親水性強，易溶于水、乙醇，難溶于乙醚、氯仿及其他有機溶劑，文獻(xiàn)報道常采用水或乙醇為溶劑對大黃藥材進(jìn)行提?。?，5］。由于大黃致瀉的主要成分為結(jié)合型蒽醌類化合物，游離型蒽醌瀉下作用較弱，臨床作為瀉下藥時須注明后下(在群藥煎好以前5～15 min加入煎煮)。本實驗以熱水(100℃)煎煮模仿水煎煮后下，以熱水和乙醇為溶劑，考查兩種溶劑對大黃蒽醌類成分提取的影響，以期闡明臨床煎煮大黃的最佳時間以及大成產(chǎn)過程中大黃的最佳提取時間，從而對大黃的應(yīng)用和生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器LC－10A型高效液相色譜儀，島津SPD－10A紫外檢測器，AUTO SCIENCE AT－330柱溫箱; KQ 3200超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器廠);RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥大黃(天津市中藥飲片廠有限公司，產(chǎn)地:甘肅，批號1206038)。對照品購自中國藥品生物制品檢定所，蘆薈大黃素(批號110795－200605)、大黃酸(批號0757－200206)、大黃素(批號110756－200110)、大黃酚(批號110796－201017)、大黃素甲醚(批號110758－200610)。鹽酸(分析純，天津化學(xué)試劑三廠)、磷酸(分析純，天津江天化學(xué)技術(shù)有限公司)、三氯甲烷(分析純，天津江天化學(xué)技術(shù)有限公司)、甲醇(色譜純，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)，水為娃哈哈飲用純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱:AGT C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm);流動相:甲醇－0.1%磷酸(85∶15);檢測波長:254 nm;流速:1.0 ml/min;柱溫:40℃。

2.2 樣品處理

2.2.1 加熱水不同煎煮時間樣品的制備分別取大黃飲片5份，每份5 g，置于500 ml燒瓶中，加熱水(水煮沸至100℃)加熱回流3次，每次100 ml，每份3煎煎煮時間均相同，分別為15、20、25、30和35 min，合并3煎煎液，減壓濃縮至50 ml，即得。

2.2.2 不同濃度乙醇煎煮樣品的制備分別取大黃飲片4份，每份5 g，置于500 ml燒瓶中，加不同濃度乙醇(室溫)加熱回流3次，每次100 ml，每煎25 min，4份乙醇濃度分別為30%、50%、70%和95%，合并3煎煎液，減壓濃縮至50 ml，即得。

2.2.3 50%乙醇不同煎煮時間樣品的制備分別取大黃飲片5份，每份5 g，置于500 ml燒瓶中，加50%乙醇(室溫)加熱回流3次，每次100 ml，每份3煎煎煮時間均相同，分別為15、20、25、30和35 min，合并3煎煎液，減壓濃縮至50 ml，即得。

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液的制備精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品，加甲醇制備混合對照品溶液(每1 ml中含蘆薈大黃素14 μg、大黃酸12 μg、大黃素10 μg、大黃酚11 μg、大黃素甲醚20 μg)。

2.3.2 游離蒽醌樣品溶液的制備精密量取大黃煎煮樣品2 ml于100 ml圓底燒瓶中，減壓濃縮至干，加甲醇25 ml，加熱回流1 h，放冷，濾過，用少量甲醇洗滌容器，收集濾液，減壓濃縮并定容至10 ml，即得。

2.3.3 總蒽醌樣品溶液的制備精密量取大黃煎煮樣品2 ml于100 ml圓底燒瓶中，減壓濃縮至干，加甲醇25 ml，加熱回流1 h，放冷，濾過，用甲醇適量洗滌容器，收集濾液，減壓濃縮至干，加8%鹽酸10 ml，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 ml，即得。

結(jié)合型蒽醌含量=總蒽醌含量－游離型蒽醌含量，色譜圖見圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取對照品適量，加甲醇溶解并定容，得到蘆薈大黃素濃度為3.5、7、14、28和56 μg/ml，大黃酸濃度為2、4、12、24和48 μg/ml，大黃素濃度為2、5、10、20和40 μg/ml，大黃酚濃度為1.1、3.3、11、22和44 μg/ml，大黃素甲醚濃度為2、5、20、40和80 μg/ml的對照品溶液的系列溶液。將上述溶液按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，以對照品峰面積值(Y)對其相應(yīng)濃度(X)做線性回歸，得回歸方程見表1，結(jié)果表明蘆薈大黃素在3.5～56 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，大黃酸在2～48 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，大黃素在2～40 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，大黃酚在1.1～55 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，大黃素甲醚在2～80 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 對照品(A)游離蒽醌樣品(B)總蒽醌樣品(C)HPLC色譜圖

表1 各成分回歸方程

2.5 精密度試驗取混合對照品溶液(蘆薈大黃素14 μg/ml、大黃酸12 μg/ml、大黃素10 μg/ml、大黃酚11 μg/ml、大黃素甲醚20 μg/ml)，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積值，得蘆薈大黃素峰面積RSD為1.33%，大黃酸峰面積RSD為1.55%，大黃素峰面積RSD為1.25%，大黃酚峰面積RSD為1.38%，大黃素甲醚峰面積RSD為1.06%。

2.6 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6和8 h按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，得蘆薈大黃素峰面積RSD為1.03%，大黃酸峰面積RSD為1.34%，大黃素峰面積RSD為1.14%，大黃酚峰面積RSD為1.08%，大黃素甲醚峰面積RSD為1.27%，表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 回收率試驗取同一份樣品，精密量取1 ml，共6份，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入一定量的對照品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果蘆薈大黃素平均回收率為99.49%，RSD為0.32%;大黃酸平均回收率為99.32%，RSD為0.56%;大黃素平均回收率為99.31%，RSD為0.44%;大黃酚平均回收率為99.59%，RSD為0.22%;大黃素甲醚平均回收率為99.27%，RSD為0.16%。結(jié)果見表2。

2.8 樣品的測定按“2.2”項下樣品處理方法制備樣品，按“2.3.2”和“2.3.3”項下溶液制備方法制備樣品溶液，“2.1”項下色譜條件測定含量，結(jié)果(以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚之和計)見表3－5和圖2。

2.9 總蒽醌的含量及轉(zhuǎn)移率根據(jù)“2.8”項下樣品測定結(jié)果，取大黃藥材，按“2.2”項下樣品處理方法制備大黃熱水提取樣品(3煎，每煎25 min)以及大黃醇提取樣品(50%乙醇3煎，每煎35 min)。另取大黃粉末(過四號篩)0.15 g，按“2.3.3”項下方法制備樣品溶液，測定以上三種樣品中總蒽醌含量，并計算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表6。

表2 回收率試驗(n=6)

表3 加熱水不同煎煮時間樣品中蒽醌類成分的含量(n=3)

表4 不同濃度乙醇煎煮樣品中蒽醌類成分的含量(n=3)

表5 50%乙醇不同煎煮時間樣品中蒽醌類成分的含量(n=3)

表6 樣品中總蒽醌的含量及轉(zhuǎn)移率(n=2)

圖2 兩種溶劑提取大黃蒽醌類成分的變化

3 討論

熱水(100℃)提取時，煎煮35 min結(jié)合蒽醌含量(0.449 2%)稍高于煎煮25 min(0.429 3%)，而煎煮25 min大黃總蒽醌和游離蒽醌含量最高(總蒽醌0.787 0%，游離蒽醌0.361 2%)，因此將25 min作為煎煮時間考查不同濃度乙醇提取時大黃蒽醌類成分的含量變化，結(jié)果提取時間相同(25 min)條件下，50%乙醇提取游離蒽醌(0.479 8%)低于70%乙醇提取(0.512 8%)，總蒽醌和結(jié)合蒽醌含量最高(總蒽醌0.873 9%，結(jié)合型蒽醌0.394 1%)，繼續(xù)考查相同濃度乙醇(50%)不同提取時間大黃蒽醌類成分的含量變化，結(jié)果煎煮35 min游離蒽醌(0.536 1%)低于煎煮30 min(0.611 1%)，但總蒽醌和結(jié)合蒽醌在煎煮30 min時含量最高(總蒽醌0.978 1%，結(jié)合型蒽醌0.442 1%)。綜上，大黃水煎煮后下以25 min為宜，總蒽醌轉(zhuǎn)移率為38.06%;而醇提以50%乙醇提取35 min為宜，總蒽醌轉(zhuǎn)移率為48.37%。

1中國藥典［S］.2010年版第一增補本.2010:77

2南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2003:102

3徐翔，酈柏平，張慧芬.大黃的研究進(jìn)展［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2003，37(4):56

4張永紅.影響大黃提取液中蒽醌含量的條件探討［J］.蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1996，22(2):9

5魏鳳玲，齊敏超，鐘加勝.大黃蒽醌類成分提取工藝優(yōu)選［J］.中國中藥雜志，1998，23(10):609

Study on effect of water and alcohol extracting process to anthraquinone content in Rhubarb

Wang Hongzhi，Qiao Xiaoli，Liu Yong，Li Wanqing
(Tianjin Nankai Hospital，Tianjin 300100)

Objective:To study the effect of water(100℃)and alcohol extracting process to anthraquinone content in Rhubarb.Methods:HPLC method was used to determine the contents of Aloe－emodin，Rhein，Rheum emodin，Chrysophanol and Physcion，choosing hot water and different concentration of alcohol as the solvent，to investigate the content of total，conjugated，and nomadic anthraquinone under different extracting time.Results:The content of total and nomadic anthraquinone were highest when extracted 25 minutes by hot water，while ethanol was used as solvent，50%of ethanol extracted 35 minutes were the best conditions.Conclusion:25 minutes was the suitable extracting time for decoction of Rhubarb by hot water，and 50%alcohol，extracting 35 minutes were proper ethanol extracting conditions，and the transfer rate of total anthraquinone reached 38%and 48%respectively.

Rhubarb，anthraquinone content，water extracting process，alcohol extracting process

R927.1

A

1006-5687(2014)01-0001-04

2013-08-30