李矗，劉圣，王珍

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省食品藥品審評(píng)認(rèn)證中心）

HPLC-ELSD法測(cè)定復(fù)方阿膠黃芪膏中黃芪甲苷含量的可靠性

李矗1，劉圣1，王珍2

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省食品藥品審評(píng)認(rèn)證中心）

目的建立復(fù)方阿膠黃芪膏中黃芪甲苷的含量測(cè)定方法。方法采用HPLC-ELSD法，Alltima C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），乙腈-水（35∶65）為流動(dòng)相，ELSD漂移管溫度103℃，載氣（N2）壓力：0.2 MPa。結(jié)果黃芪甲苷在88.1～440.5μg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r＝0.9998（n＝5）。平均回收率97.05%，RSD＝1.22%。結(jié)論HPLC-ELSD法準(zhǔn)確可靠，可用于復(fù)方阿膠黃芪膏的質(zhì)量控制。

黃芪；色譜法，高壓液相；質(zhì)量控制

復(fù)方阿膠黃芪膏由阿膠、黃芪、山楂、枸杞子、黑芝麻、龍眼肉、明膠等制成，具有健脾消積，行氣和胃之功［1］。黃芪為方中臣藥，而黃芪甲苷為黃芪的主要活性成分之一，故選擇黃芪甲苷作為控制該產(chǎn)品質(zhì)量的定量指標(biāo)，黃芪甲苷含量測(cè)定常用薄層掃描法，但該法準(zhǔn)確度差，重復(fù)性不強(qiáng)，操作繁瑣［2-4］，而HPLC-ELSD法可快速、有效準(zhǔn)確地測(cè)定黃芪甲苷的含量。

1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜儀（美國(guó)），包括：四元泵，在線脫氣機(jī)，柱溫箱，化學(xué)工作站（chimstation system工作站），Alltech2000ELSD檢測(cè)器（美國(guó)）；梅特勒托利多xp56型百萬(wàn)分之一電子天平（瑞士）；賽多利斯BSA224S電子分析天平（德國(guó)）。復(fù)方阿膠黃芪膏（批號(hào)：130110、130112、130114）和陰性制劑均由安徽省立醫(yī)院提供；黃芪甲苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110781-200512）；乙腈和甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）柱；流動(dòng)相：乙腈-水（35：65）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL／min；ELSD漂移管溫度：103℃，載氣（N2）壓力：0.2MPa。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1毫升含0.4405 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取復(fù)方阿膠黃芪膏適量，研勻，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心（4000 r／min，5 min），精密量取上清液25 mL置分液漏斗中，用水飽和正丁醇提取5次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，用2%氫氧化鈉試液洗滌兩次，每次25 mL，棄去洗滌液，再用正丁醇飽和的水洗滌兩次，每次25 mL，棄去水溶液，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm的濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺黃芪的缺味陰性制劑，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下的方法處理，即得。

2.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各20μL，注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，供試品溶液與其他組分分離度良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。理論板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)算為6533，黃芪甲苷峰與相鄰峰分離度為3.88（R＞1.5），拖尾因子為0.99（0.95≤T≤1.05），符合藥典規(guī)定。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為0.4405 mg／mL的對(duì)照品溶液2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述對(duì)照品溶液各20μL，依次注液相色譜儀中，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品濃度的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程為：Y＝1.4364X-0.3365（r＝0.9998，n＝5）。結(jié)果表明：黃芪甲苷濃度在88.1～440.5μg／mL之間濃度對(duì)數(shù)值與峰面積對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積值，分別為：1324.9、1375.2、1373.3、1359.0、1380.5、1385.6，RSD為1.63%，結(jié)果表明：表明本法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別間隔0、2、4、6、8、10 h后依法測(cè)定，測(cè)定峰面積值，分別為：1305.9、1377.8、1387.8、1377.4、1343.4、1322.3，RSD為2.49%，結(jié)果表明：表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)（130110）的樣品6份，分別按上述方法制備、測(cè)定黃芪甲苷含量，結(jié)果含量分別為：0.4532 mg／粒、0.4499 mg／粒、0.4429 mg／粒、0.4299 mg／粒、0.4339 mg／粒、0.4430 mg／粒，平均含量為0.4421 mg／粒，RSD為2.03%，結(jié)果表明：表明本法重現(xiàn)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品（0.4421 mg／粒）9份，分別精密加入一定量的黃芪甲苷對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備并測(cè)定，結(jié)果表明：本法具有良好的回收率，見(jiàn)表1。

2.11 樣品測(cè)定 按上述色譜條件，依法對(duì)3批樣品中黃芪甲苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果：批號(hào)130110含量為0.4421 mg／粒、批號(hào)130112含量為0.4609 mg／粒、批號(hào)130114含量為0.4655 mg／粒。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果

3 討論

制備供試品溶液時(shí)，曾對(duì)洗滌萃取后的正丁醇溶液選擇了2%NaOH溶液和氨試液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以2%NaOH溶液洗滌正丁醇所得供試品溶液中黃芪甲苷的含量較高。還對(duì)萃取后是否通過(guò)D101型大孔吸附樹脂柱進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)D101型大孔吸附樹脂柱對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響，不通過(guò)D101型大孔吸附樹脂柱的供試品溶液，在黃芪甲苷峰附近也無(wú)干擾峰，故最終確定此供試品溶液的制備方法。

關(guān)于流動(dòng)相的選擇，考察的2010年版藥典中黃芪甲苷項(xiàng)下的流動(dòng)相乙腈—水（32∶68）和相關(guān)報(bào)道中的流動(dòng)相乙腈—水（30∶70）及乙腈—水（35∶65），結(jié)果均能使黃芪甲苷達(dá)到藥典規(guī)定的分離度和理論塔板數(shù)，但乙腈—水（32∶68）和乙腈—水（30∶70）相對(duì)分離時(shí)間較長(zhǎng)，故選擇乙腈—水（35∶65）為流動(dòng)相進(jìn)行分析［5-8］。

黃芪甲苷的含量測(cè)定方法報(bào)道多為薄層掃描法，但該方法結(jié)果準(zhǔn)確性受顯色效果的影響較大。而本研究結(jié)果顯示以蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定黃芪甲苷的含量，黃芪甲苷濃度在88.1～440.5μg／mL之間濃度對(duì)數(shù)值與峰面積對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，而且以蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定精密度良好、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（2010年版一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：175.

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［3］ 張昌文，彭宣文.薄層掃描法測(cè)定升胃顆粒劑中黃芪甲苷的含量［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（9）：20.

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Determ ination of astragaloside IV in Compound Ejiao Huangqi Extract by HPLC-ELSD method

LIChu*，LIU Sheng，WANG Zhen（*The Affiliated Anhui Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230001，China）

ObjectiveTo establish amethod for the determination of astragaloside IV in Compound Ejiao Huangqi Extract.Method HPLC-ELSDmethod was used in the quantitative analysis by using a Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）column.The mobile phase was acetonitrile-water（35：65），ELSD evaporator tube temperature was 103℃，and pressure of carrier-gas（N2）was0.2MPa.ResultsThe calibration curve had good linear relationship within the range of 88.1-440.5μg／m L for astragaloside IV（r＝0.9998，n＝5）.The average recovery was 97.05% and RSD＝1.22%.ConclusionThe HPLC-ELSDmethod is accurate and reliable，which can be used for the quality control of compound Ejiao Huangqi Extract.

Astragalusmembranaceus；Chromatography，high pressure liquid；Quality control

R282.71

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.06.006

2014-06-26）

李矗，副主任藥師，Email：leetrue2000＠126.com