王曉婧，梅曉冬

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科，合肥 230001）

·基礎(chǔ)研究·

不同濃度粒巨細(xì)胞集落刺激因子及白介素-4對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

王曉婧，梅曉冬

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科，合肥 230001）

目的探討不同濃度小鼠粒／巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和白介素-4（IL-4）對(duì)小鼠骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)的影響，探索樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的適宜條件。方法采用細(xì)胞裂解法分離得到Balb／c小鼠骨髓單個(gè)核樣細(xì)胞，分為多組，分別加入不同濃度GM-CSF和IL-4，并設(shè)置空白對(duì)照組，共培養(yǎng)7 d，每天觀察各組細(xì)胞形態(tài)，隔天拍照。第7天收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞表面樹(shù)突狀細(xì)胞標(biāo)志分子CD11c的表達(dá)率。結(jié)果低濃度GM-CSF及IL-4可培養(yǎng)出高純度小鼠骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞，高濃度GM-CSF及IL-4可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，GM-CSF和IL-4的合理細(xì)胞誘導(dǎo)濃度范圍分別為5～100μg／L和2.5～50μg／L。結(jié)論合適濃度的GM-CSF及IL-4可誘導(dǎo)小鼠骨髓單個(gè)核樣細(xì)胞向樹(shù)突狀細(xì)胞分化，獲得大量樹(shù)突狀細(xì)胞。

樹(shù)突細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；巨噬細(xì)胞集落刺激因子；白細(xì)胞介素4

圖1 骨髓來(lái)源單個(gè)核樣細(xì)胞培養(yǎng)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(×400)

圖2 合適濃度的細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d時(shí)細(xì)胞高表達(dá)CD11c的流式細(xì)胞圖

樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）在組織內(nèi)廣泛分布，但其數(shù)量極少，如在血液中只占血液細(xì)胞總數(shù)的不到1%。如何獲得大量的DC就成為進(jìn)行DC相關(guān)研究首先必須解決的問(wèn)題。目前獲取DC的方法有多種。主要有免疫磁珠直接篩選（MACS）和體外誘導(dǎo)法［1］。磁珠分選法費(fèi)用昂貴且操作步驟復(fù)雜，最終分離到的DC數(shù)量又較有限，實(shí)驗(yàn)成本較高。體外誘導(dǎo)法相對(duì)較為經(jīng)濟(jì)方便。此方法系對(duì)采集的單核細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞，用粒細(xì)胞／巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細(xì)胞介素4（IL-4）等細(xì)胞因子進(jìn)行體外定向誘導(dǎo)分化，得到未成熟的DCs，再根據(jù)研究需要使用不同抗原刺激得到成熟的DC。本文探索采用不同濃度細(xì)胞因子誘導(dǎo)DCs生成的效果，確定誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的合適細(xì)胞因子濃度，為進(jìn)一步研究DCs創(chuàng)造必要條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 重組小鼠GM-CSF、重組小鼠IL-4購(gòu)自美國(guó)PerproTech公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Hycolon公司，紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自Beyotime公司，熒光抗體PE anti-mouse CD11c美國(guó)eBioscience公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性Balb／c小鼠，6周齡，體質(zhì)量20～25 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于安徽省立醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 骨髓細(xì)胞的制備 頸椎脫位法處死小鼠，無(wú)菌狀態(tài)下取股骨和脛骨，浸泡在RPMI-1640培養(yǎng)基中。用1 mL注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液，從骨干的一端刺入骨髓腔，反復(fù)沖洗，直至骨變白，將骨髓沖洗至15mL離心管中，離心，1 200 r／min，共5min，棄去上清，以1∶5加入預(yù)溫的無(wú)菌紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打混勻，于室溫下靜置2 min溶解紅細(xì)胞后，再次離心，1 200 r／min，共5 min，棄上清。用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，以完全RPMI-1640（含10% FBS，20萬(wàn)U／L青霉素，20萬(wàn)U／L鏈霉素）重懸，分裝于細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng)4 h，去除未貼壁細(xì)胞，以完全1640調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL，加入24孔培養(yǎng)板中，并在每孔中加入完全培養(yǎng)基2 mL，再加入不同濃度rmGM-CSF及IL-4，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃，含5%CO2的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天半量換液，同時(shí)補(bǔ)足相同濃度細(xì)胞因子，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，用吸管輕輕吹打后收集所有懸浮細(xì)胞。

其中按照培養(yǎng)基中所含細(xì)胞因子濃度不同共分為6組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。第1組：GM-CSF終濃度為5μg／L，IL-4終濃度為2.5μg／L，第2組GM-CSF終濃度為10μg／L，IL-4終濃度為5μg／L，第3組：GM-CSF終濃度為30μg／L，IL-4終濃度為15μg／L，第4組：GM-CSF終濃度為100μg／L，IL-4終濃度為50μg／L，第5組：GM-CSF終濃度為200μg／L，IL-4終濃度為100μg／L，第6組為空白對(duì)照組，培養(yǎng)基中未加入細(xì)胞因子。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 每天用光學(xué)倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)DC形態(tài)學(xué)變化，并于第0，3，5，7天拍攝細(xì)胞照片。

1.5 DC流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型 收集上述各組的細(xì)胞，離心，1 200 r／min，共5 min，棄上清，PBS漂洗2次，每組細(xì)胞用PBS調(diào)至濃度l×105個(gè)／mL，分裝于3個(gè)小管中，每管100μL，分別加入4μLPE抗鼠CD11c，于4℃避光標(biāo)記30 min，PBS洗滌細(xì)胞2次，最后用400μL的PBS懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析DC的CD11c的陽(yáng)性表達(dá)率。

1.6 流式細(xì)胞圖分析 采用Flowjo流式細(xì)胞圖分析軟件分析流式圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件，所有數(shù)據(jù)用±s表示，資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察 每只小鼠可獲得骨髓細(xì)胞數(shù)（2.4～3.6）×107個(gè)，置于37℃，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)4 h后，部分細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)液中可見(jiàn)大量的懸浮細(xì)胞，去除懸浮細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，體積小，多為圓形，第2組及第3組可見(jiàn)細(xì)胞集落形成。第3天，各組細(xì)胞體積增大，部分細(xì)胞呈半懸浮狀態(tài)，呈梭形，蝌蚪狀，不規(guī)則形，第4、5組細(xì)胞數(shù)量減少，可見(jiàn)細(xì)胞碎片。第5天時(shí)可見(jiàn)1，2，3組懸浮細(xì)胞增多，部分細(xì)胞可見(jiàn)棘突，培養(yǎng)至第7天，第1、2、3、4組細(xì)胞集落分散，大量細(xì)胞懸浮，細(xì)胞表面可見(jiàn)多個(gè)突起，為未成熟DC，而第5組細(xì)胞稀疏，部分出現(xiàn)空泡，無(wú)典型DCs，見(jiàn)圖1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型 培養(yǎng)第7天時(shí)，收集各組細(xì)胞經(jīng)臺(tái)竇藍(lán)染色法檢測(cè)，各組活細(xì)胞率大于90%，提示培養(yǎng)細(xì)胞生理狀態(tài)正常。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD11c分子結(jié)果顯示第1、2、3、4組培養(yǎng)，CD11c表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞比例分別為（89.67± 8.66）%，（90.51±9.49）%，（93.34±5.16）%，（56.73±6.27）%，第5組及第6組分別為0%，11.23%，第1～4組與5、6兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。圖示為第2組流式細(xì)胞結(jié)果，CD11c陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到90.5%。結(jié)果顯示，本研究所采用的方法，能高效誘導(dǎo)骨髓單個(gè)核樣細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞。所使用的刺激因子濃度較為合理。

3 討論

DC是體內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞，在腫瘤免疫、器官移植免疫及抗感染免疫中至關(guān)重要，和DC相關(guān)的許多臨床研究正在開(kāi)展［1-4］。尤其在腫瘤免疫方面，DC疫苗已經(jīng)成為一種新的腫瘤治療方法，已有文獻(xiàn)報(bào)道將DC腫瘤疫苗已用于非小細(xì)胞肺癌的I期臨床研究［5］，并獲得了良好的治療效果。因此如何能簡(jiǎn)單、高效獲得大量高純度DC是很多研究的前提條件。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道中GM-CSF和IL-4的誘導(dǎo)劑量差別很大，在2μg／L至500μg／L之間［6-9］。本研究探索了小鼠DCs體外培養(yǎng)中細(xì)胞因子的最適宜濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度的細(xì)胞因子會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，GM-CSF和IL-4適宜濃度范圍分別為5～100μg／L和2.5～50μg／L，在該濃度范圍中，低濃度與較高濃度細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)出的未成熟DC數(shù)量及純度上無(wú)明顯差別，能獲得較高純度的DC。CD11c是DC表面所特有的標(biāo)志性蛋白，在未成熟和成熟DC表面均有高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)室研究中常用CD11c陽(yáng)性與否來(lái)判斷所研究的細(xì)胞是否是DC。本研究中誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的細(xì)胞，其CD11c的陽(yáng)性率能高達(dá)90%以上，顯示本研究所使用的細(xì)胞因子誘導(dǎo)濃度較為合理，誘導(dǎo)得到的細(xì)胞絕大多數(shù)為DC。研究結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)方法可行，為DC細(xì)胞相關(guān)研究，提供了可靠的DC細(xì)胞獲得手段，為進(jìn)一步研究DC建立了良好基礎(chǔ)。

（本文圖1，2見(jiàn)插圖2-1）

［1］ Steinman RM，Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice.Ⅰ.Morphology，quantification，tissue distribution［J］.J Exp Med，1973，137（5）：1142-1162.

［2］ Luo J，Li J，Chen RL，et al.Autologus dendritic cell vaccine for chronic hepatitis B carriers：A pilot，open label，clinical trial in human volunteers［J］.Vaccine，2010（28）：2497-2504.

［3］ Rahma OE，Ashtar E，Czystowska M，et al.A gynecologic oncology group phase II trial of two p53 peptide vaccine approaches：subcutaneous injection and intravenous pulsed dendritic cells in high recurrence risk ovarian cancer patients［J］.Cancer Immunol Immunother，2012，61（3）：373-384.

［4］ LesterhuisWJ，SchreibeltG，Scharenborg NM，et al.Wildtype and modified gp100 peptide-pulsed dendritic cell vaccination of advanced melanoma patients can lead to long-term clinical responses independent of the peptide used［J］.Cancer Immunol Immunother，2011，60（2）：249-260.

［5］ Um SJ，Choi YJ，Shin HJ，et al.Phase I study of autologous dendritic cell tumor vaccine in patients with nonsmall cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2010，70（2）：188-194.

［6］ 蘇鈺，高雪，王錦玲，等.大鼠骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞吞噬功能的超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.生物技術(shù)通訊，2012，23（3）：407-410.

［7］ 汪國(guó)營(yíng)，張琪，劉煒.大鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化［J］.器官移植，2011，2（3）：135-140.

［8］ 付必莽，何曉順，余思.小鼠骨髓源半成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)與初步鑒定［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，30（4）：430-435.

［9］ 孫國(guó)龍，王凱忠，周莉.小鼠骨髓及脾臟來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16（3）：408-411.

Generation of dendritic cells with appropriate concentration of granu Iocyte-macrophage coIony-stimu Iating factor and interleukin-4

WANG Xiaojing，MEI Xiaodong（Department of Respiratory，Anhui Provincial Hospital，Hefei230001，China）

MEIXiaodong，Email：hfmχd＠sina.com

ObjectiveTo investigate the appropriate concentration range ofmurine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（GM-CSF）and interleukin-4（IL-4）in incubating mouse bone marrow monocytes-like cellsand proper conditions for dendritic cell differentiation.Methods The progenitor of dendritic cellswere isolated from bone marrow of Balb／cmice，and incubated in different dose ofmouse granuIocyte-macrophage coIony-stimu Iating factor and interleukin-4 for continuously seven days，themorphology of cells in each group were observed undermicroscope and snapped with digital camera every other day.The expression of CD11c was detected with flow cytometry.ResultsMorphological observation revealed thatmouse bonemarrow monocytes-like cells changed remarkably when cultured with low dose of cytokine.Cells became large and showed dendritic protruding on their surface.Furthermore，most cells were CD11c positive when detected by flow cytometry.The appropriate GM-CSF and IL-4 dose rangewere5 μg／L～100μg／L and 2.5μg／L～50μg／L respectively，while cytokines of overhigh concentration cause cell death.ConclusionDendritic cells can be derived from bonemarrowmonocytes-like cellswith appropriate dose of GM-CSF and IL-4 treatmentwith High purity DCs.

Dendritic cells；Cell culture techniques；Macrophage colony-stimulating factor；Interleukin-4

R329.24

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.02.017

2013-05-05）

2013年度安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1308085MH115）

王曉婧，碩士在讀，Email：ahslyywxj＠gmail.com

梅曉冬，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：hfmxd＠sina.com