姚綱 張健鵬 胡紅焱 梁慧

D-乳酸(右旋乳酸)作為一種重要的化工原料, 在食品、醫(yī)藥、高分子材料等領(lǐng)域有著廣泛的用途, 具有重要的經(jīng)濟價值［1］。乳酸的生產(chǎn)大多采用發(fā)酵法, 發(fā)酵法制備D-乳酸的主要技術(shù)瓶頸是缺乏產(chǎn)高光學(xué)純度(光學(xué)純度>97%)D-乳酸的菌株［2］。作者從某發(fā)酵食品中分離并純化出9株野生菌株, 產(chǎn)D-乳酸光學(xué)純度達100%, 將其命名為SZD菌株, 初步鑒定為乳桿菌屬(lactobacillus)。本文擬利用API 50CH鑒定系統(tǒng)對這9株野生菌株進行進一步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 9株SZD菌株均分離自陜西的一種發(fā)酵食品, 編號分別為 SZD-1、SZD-2、SZD-3、SZD-4、SZD-5、SZD-6、SZD-8、SZD-9、SZD-10, 其中具有代表性的4株(SZD-2、SZD-5、SZD-9、SZD-10)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心, 保藏編號分別為：CGMCC No.6891～6894。

MRS肉湯培養(yǎng)基基礎(chǔ)(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司), API50 CHL培養(yǎng)基及API50 CH碳水化合物鑒定試劑條均購自法國生物梅里埃公司。

1.2 方法 按照API50 CH碳水化合物鑒定試劑條說明書進行。先制備相當(dāng)于2個麥?zhǔn)蠞岫鹊腟ZD菌株的菌懸液, 然后將菌懸液加到試劑條上的50個微生化管中, 最后用無菌液體石蠟封管靜置35℃培養(yǎng), 24 h及48 h各觀察1次結(jié)果。試劑條變?yōu)辄S色(25號管變?yōu)楹谏?為陽性反應(yīng), 變?yōu)榫G色(25號管除外)為弱陽性反應(yīng), 不變色為陰性反應(yīng), 以48 h觀察到的結(jié)果作為最終結(jié)果。

2 結(jié)果

SZD菌株的碳水化合物發(fā)酵試驗結(jié)果見表1。

表1 SZD菌株碳水化合物發(fā)酵試驗結(jié)果

3 討論

形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)及代謝產(chǎn)物等表型特征是鑒定細菌最基本的依據(jù)。通過前期研究得知, 9株SZD菌株均為G+短桿菌, 無芽孢, 無分叉, 無動力, 兼性厭氧, 能在pH值為4.5的培養(yǎng)基中生長, 15℃生長良好, 45℃遲緩生長, 接觸酶及氧化酶均為陰性, 不產(chǎn)吲哚和硫化氫, 不液化明膠, 從葡萄糖產(chǎn)乳酸但不產(chǎn)氣。根據(jù)以上表型特征, SZD菌株鑒定為乳桿菌屬, 但無法將其鑒定至種的水平［3］。

乳酸桿菌種水平的表型鑒定主要依據(jù)碳水化合物發(fā)酵試驗。傳統(tǒng)的發(fā)酵試驗需配制或購買各種生化反應(yīng)管, 費時費力, 且反應(yīng)管種類較少, 使結(jié)果的判定受限。法國梅里埃公司研發(fā)的API 50CH鑒定系統(tǒng)專用于乳酸桿菌和相關(guān)菌的鑒定, 是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣、種類最全、最受微生物學(xué)家推崇的國際標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品。一個試劑條包括49種碳水化合物的發(fā)酵反應(yīng), 接種菌后反應(yīng)48 h即可判定結(jié)果。該系統(tǒng)試劑反應(yīng)靈敏, 方法簡單快捷, 鑒定結(jié)果可靠［4,5］。該系統(tǒng)的缺點是價格昂貴, 不適于大規(guī)模菌種的鑒定, 而且鑒定到種水平的分辨力有限。Corsetti A等［6］利用API 50CH鑒定系統(tǒng)分析了317株可能為乳酸菌的菌株, 結(jié)果僅38%分離株被鑒定到種的水平。作者采用這一鑒定系統(tǒng)對9株SZD菌株進行的碳水化合物的發(fā)酵試驗結(jié)果表明, 所有SZD菌株均發(fā)酵甘露醇、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖及甘露糖, 除SZD-4外均發(fā)酵麥芽糖, 部分菌株(SZD-3、SZD-4、SZD-5、SZD-9)發(fā)酵葡萄糖鹽。所有菌株不發(fā)酵乳糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、纖維二糖、松三糖、木糖及海藻糖, 根據(jù)以上特性, 將SZD菌株鑒定為棒狀乳桿菌(lactobacillus coryniformis)。

目前棒狀乳桿菌分為棒狀亞種(lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis)和扭曲亞種(lactobacillus coryniformis subsp.torquens)。棒狀乳桿菌棒狀亞種大部分(>90%)發(fā)酵鼠李糖, 部分(11%～89%)水解七葉靈并發(fā)酵水楊苷、山梨醇、蜜二糖、棉子糖。棒狀乳桿菌扭曲亞種大部分(>90%)不水解七葉靈, 大部分(>90%)不發(fā)酵鼠李糖、水楊苷、山梨醇、蜜二糖、棉子糖［7-9］。所有SZD菌株均水解七葉靈并發(fā)酵水楊苷, 部分菌株(SZD-1、SZD-2、SZD-3、SZD-10)發(fā)酵山梨醇, 與棒狀乳桿菌扭曲亞種的特性不符；所有SZD菌株不發(fā)酵蜜二糖、棉子糖, 除SZD-3外均不發(fā)酵鼠李糖, 與棒狀乳桿菌棒狀亞種的特性不符。因此, SZD菌株不能鑒定為棒狀乳桿菌兩個已知亞種的任何一種, 很可能為棒狀乳桿菌一個新的亞種。SZD菌株分類地位的最終確定還需利用分子生物學(xué)技術(shù)對其基因型特征進行鑒定。

［1］ Oshiro M, Shinto H, Tashiro Y, et al.Kinetic modeling and sensitivity analysis of xylose metabolism in Lactococcus lactis IO-1.J Biosci Bioeng, 2009,108(5):376-384.

［2］ Jamshidian M, Tehrany EA,Imran M, et al.Poly-Lactic Acid:Production, Applications, Nanocomposites, and Release Studies.Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety.2010,9(5):552-571.

［3］ De Vos P, Garrity G, Jones D, t al.Bergey's manual of systematic bacteriology.2nd ed.Vol.3.New York: Springer.p, 2009:465-472.

［4］ 董銀蘋,于紅霞,李鳳琴.乳酸桿菌分離鑒定技術(shù)研究進展.衛(wèi)生研究, 2008,37(04):508-510.

［5］ 宋嵩文.API鑒定系統(tǒng)在食品微生物學(xué)檢驗中的應(yīng)用.醫(yī)藥前沿, 2012,02(16):84-86.

［6］ Corsetti A, Lavermicocca P, Morea M, et al.Phenotypic and molecular identification and clustering of lactic acid bacteria and yeasts from wheat (species Triticum durum and Triticum aestivum)sourdoughs of Southern Italy.Int J Food Microbiol, 2001,64(1-2):95-104.

［7］ R.E.布欽南,N.E.吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊(中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組).第8版.北京:科學(xué)出版社, 1984:799-811.

［8］ De Vos P, Garrity G, Jones D, et al.Bergey's manual of systematic bacteriology.2nd ed.Vol.3.New York: Springer, 2009:484-487.

［9］ 凌代文,東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方.北京:中國輕工業(yè)出版社, 1999:8-11.