季 遷李 哲李 敏劉 芳姜殿軍

（1 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 100034；2 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

銀杏葉提取物的長(zhǎng)期毒性研究

季 遷1李 哲2李 敏1劉 芳2姜殿軍1

（1 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 100034；2 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

目的 選用高于臨床擬用劑量30倍和120倍的劑量組進(jìn)行“限度實(shí)驗(yàn)”觀察其長(zhǎng)期毒性作用。方法 將90只Wister大鼠隨機(jī)分3組，即生理鹽水對(duì)照組，銀杏葉提取物低、高劑量組，灌胃給藥24周后檢測(cè)血液學(xué)和血液生化指標(biāo)，同時(shí)解剖并摘取各組織臟器，計(jì)算臟器系數(shù)，進(jìn)行病理學(xué)檢查分析。結(jié)果 與對(duì)照組比較，銀杏葉提取物高、低劑量組大鼠的臟器系數(shù)未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），但多項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)發(fā)生顯著改變。結(jié)論 用滲漉法制備的銀杏葉提取物對(duì)大鼠有降血脂、抗血栓作用，長(zhǎng)期大劑量使用可顯著改變多項(xiàng)血液學(xué)和血液生化指標(biāo)，還可能引起消化性潰瘍與腫瘤。

銀杏葉提取物；長(zhǎng)期毒性

隨著對(duì)銀杏葉的化學(xué)成分和藥理作用的深入研究，證實(shí)銀杏葉提取物對(duì)多種疾病有確切的治療作用，尤其在防治心腦血管疾病方面被廣泛開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)用滲漉法制備銀杏葉提取物，并選用高于臨床擬用劑量30倍和120倍銀杏葉提取物的低、高劑量組長(zhǎng)期給藥，進(jìn)行“限度實(shí)驗(yàn)”，觀察銀杏葉提取物是否具有毒副作用。通過(guò)系統(tǒng)的毒理學(xué)研究，為確定其最大安全劑量，指導(dǎo)臨床用藥和制藥企業(yè)控制銀杏葉產(chǎn)品質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

主要藥品和試劑：銀杏葉、蒸餾水、生理鹽水、無(wú)水乙醇、丙酮、甲醛、烏拉坦。

主要器材及物品：滲漉器（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥理教研室提供）；全自動(dòng)血液分析儀（美國(guó)BECKMAN COULTER Gen.S）；全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；冰凍病理切片機(jī)（德國(guó)SLEE公司）；顯微鏡（美國(guó)VSI公司）；SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件等。

動(dòng)物：Wister大鼠90只（體質(zhì)量60～70 g），雌雄各半，由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物合格證：SCSK，遼2003-0016）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銀杏葉提取物的制備

按正規(guī)流程操作，制備銀杏葉滲漉液，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收得浸膏，用丙酮溶解，冰水浴下超聲波分散，室溫靜置24 h，過(guò)濾后揮發(fā)丙酮，即得銀杏葉粗提物。

1.2.2 銀杏葉提取物的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：將90只Wister大鼠隨機(jī)分為3組，每組雌雄各半。即生理鹽水對(duì)照組、低劑量組和高劑量組。

1.2.2.2 給藥方式：每天早晚各1次灌胃給藥，共24周。低劑量組：按1.03 g/（kg·d）劑量，相當(dāng)于人臨床日劑量的30倍。高劑量組：按4.12 g/（kg·d）劑量，相當(dāng)于人臨床日劑量的120倍。生理鹽水對(duì)照組：將生理鹽水按照20 mL/（kg·d）劑量。

1.2.2.3 觀察指標(biāo)

①綜合指標(biāo)觀察：包括動(dòng)物外觀體征、行為活動(dòng)和糞便性狀等。每天給藥前稱(chēng)重，再定量給藥，并計(jì)算平均食物攝入率。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中若有動(dòng)物死亡及時(shí)解剖，觀察、推測(cè)死亡原因。在末次給藥后，禁食15 h，不禁水，稱(chēng)重。②血液學(xué)和血液生化指標(biāo)觀察：烏拉坦麻醉，腹腔主動(dòng)脈采血，每只動(dòng)物采3 mL全血不加抗凝劑，2 mL全血加0.15 g枸櫞酸鈉抗凝，供檢測(cè)。③采血后解剖實(shí)驗(yàn)大鼠，摘取主要臟器稱(chēng)重，計(jì)算臟器系數(shù)（臟器系數(shù)=臟器重量/體質(zhì)量）。并做病理切片，進(jìn)行病理學(xué)檢查分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)動(dòng)物一般體征影響

給藥過(guò)程中，高、低劑量組動(dòng)物毛色光澤逐漸消失，食物攝入量顯著減少。其中高劑量組部分動(dòng)物腹部脹大，觸有腫塊。給藥2個(gè)月后，高、低劑量組動(dòng)物體質(zhì)量明顯減輕，高劑量組動(dòng)物出現(xiàn)死亡。經(jīng)解剖觀察，推測(cè)動(dòng)物死于消化系統(tǒng)潰瘍穿孔。

2.2 臟器系數(shù)的改變

給藥24周后，將動(dòng)物麻醉，解剖并取出主要臟器，測(cè)定臟器系數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。與生理鹽水對(duì)照組相比較，P＞0.05。

2.3 血液學(xué)指標(biāo)的改變

服用銀杏葉24周后，高、低劑量組大鼠的血液學(xué)指標(biāo)有多項(xiàng)發(fā)生顯著的改變。其中，中性粒細(xì)胞百分比，單核細(xì)胞百分比、嗜酸細(xì)胞百分比、嗜堿細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞容積和血小板計(jì)數(shù)顯著降低（P＜0.01），而淋巴細(xì)胞百分比和血小板平均體積則顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)表2。

2.4 血液生化指標(biāo)的改變

服用銀杏葉24周后，高、低劑量組大鼠的血液生化指標(biāo)有多項(xiàng)發(fā)生顯著的改變。其中，尿素、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總蛋白、白蛋白和肌酸磷酸激酶水平顯著下降（P＜0.01）；凝血酶原時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）；血鉀降低，血鈉升高（P＜0.01），但血氯水平改變不顯著（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表1 不同劑量銀杏葉對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響[()，mg/g]

表1 不同劑量銀杏葉對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響[()，mg/g]

注：與對(duì)照組相比較*P＞0.05

組別 心 肝 脾 肺 腎 腎上腺 胸腺 子宮 睪丸 腦對(duì)照組 5.3±0.3 43.7±6.6 3.5±1.2 10.8±2.0 7.7±1.3 0.3±0.1 1.3±0.6 1.9±0.6 11.0±1.2 8.3±0.8低劑量組 5.0±1.1* 42.9±10.3* 4.4±2.8* 10.0±8.7* 7.5±5.0* 0.3±0.1* 1.3±0.3* 2.0±0.5* 10.5±1.3* 8.1±1.8*高劑量組 4.6±0.8* 41.6±5.4* 3.9±2.1* 10.2±1.0* 6.6±0.6* 0.4±0.1* 0.9±0.4* 1.2±0.9* 11.1±1.9* 7.8±1.3*

表2 不同劑量銀杏葉對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（）

表2 不同劑量銀杏葉對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；●P＜0.01

血液學(xué)指標(biāo) 對(duì)照組 低劑量組 高劑量組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(109/L) 14.83±80.08 13.68±15.32 15.01±8.76中性粒細(xì)胞百分比(%) 21.63±7.19 20.92±14.29* 11.26±4.97*淋巴細(xì)胞百分比(%) 62.93±12.74 66.20±2.33● 78.66±7.32●單核細(xì)胞百分比(%) 10.59±3.89 8.54±3.90* 6.28±2.54*嗜酸細(xì)胞百分比(%) 1.88±0.95 1.82±0.89* 1.18±1.07*時(shí)間細(xì)胞百分比(%) 0.94±0.55 0.87±0.60* 0.62±0.13*紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(1012/L) 6.58±1.68 5.16±1.59* 4.52±1.50*血紅蛋白含量(g/L) 105.44±19.82 104.56±20.62* 71.40±22.12*紅細(xì)胞比容(%) 0.32±0.07 0.33±0.07* 0.22±0.07*平均紅細(xì)胞體積(fL) 49.50±3.84 49.31±3.70 49.40±2.10平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(pg) 16.36±2.32 15.88±1.94 15.94±0.74平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(g/L) 329.33±26.77 321.33±21.70 322.60±15.98紅細(xì)胞分布寬度(%) 14.26±1.39 ±14.53±1.68 14.12±1.30血小板計(jì)數(shù)(109/L) 559.8±142.10 529.44±191.14* 431.80±146.69*血小板平均體積(fL) 5.95±0.19 6.02±0.23● 6.58±0.82●網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(109/L) 4.34±1.89 5.11±2.19 5.09±2.23

2.5 大鼠臟器的病理學(xué)改變

圖1 大鼠腸黏膜上疑似淋巴瘤

表3 不同劑量銀杏葉對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響（）

表3 不同劑量銀杏葉對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響（）

注：與對(duì)照組比較*P＜ 0.01；●P＜ 0.01；○P＞0.05

血液生化學(xué)指標(biāo) 對(duì)照組 低劑量組 高劑量組尿素(mmol/L) 11.59±1.19 7.36±1.31* 6.86±1.22*肌酐(μmol/L) 37.08±2.57 28.40±8.64* 25.13±4.45*三酰甘油(mmol/L) 0.92±0.07 0.67±0.15* 0.57±0.18*總膽固醇(mmol/L) 1.99±0.16 1.29±0.21* 1.32±0.34*

服用銀杏葉24周，高劑量組大鼠中有85 %出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的胃或十二指腸潰瘍，有50 %腹腔中腸黏膜上出現(xiàn)腫瘤，有的長(zhǎng)徑可達(dá)6 cm，腫瘤及其病理切片如圖1、2所示。腫瘤組織細(xì)胞呈卵圓形，有典型的濾泡中心細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，為腸黏膜淋巴瘤。

圖2 淋巴瘤病理切片（HE染色，×400）

3 討 論

銀杏葉為銀杏科植物銀杏的干燥葉，銀杏葉提取物中富含天然的藥理活性成分黃酮苷和銀杏內(nèi)酯，大量實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明這些活性成分具有明顯的抑制血小板聚集作用[1]。

目前，有關(guān)銀杏葉制劑的毒性研究報(bào)道很多，基本結(jié)論是安全可靠，外觀體征、行為活動(dòng)、體質(zhì)量增長(zhǎng)均無(wú)異常變化；血液學(xué)和血液生化學(xué)檢查均在正常范圍；組織病理學(xué)檢查未見(jiàn)明顯異常。但有關(guān)研究所采用的劑量較小，大鼠的平均治療劑量為34 mg/kg，也許不能完全反映出藥品的毒性。本實(shí)驗(yàn)選用兩個(gè)高于臨床擬用劑量30倍和120倍的劑量組，進(jìn)行限度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，大鼠服用銀杏葉提取物24周后，高、低劑量組的血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)有多項(xiàng)發(fā)生非常顯著的改變。其中，中性粒細(xì)胞百分比，單核細(xì)胞百分比、嗜酸細(xì)胞百分比、嗜堿細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞容積和血小板計(jì)數(shù)顯著降低（P＜0.01），而淋巴細(xì)胞百分比和血小板平均體積則顯著增加（P＜0.01）；尿素、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總蛋白、白蛋白肌和酸磷酸激酶水平顯著下降（P＜0.01）；凝血酶原時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）；血鉀降低，血鈉升高（P＜0.01），但血氯水平改變不顯著（P＞0.05）。

各臟器系數(shù)與正常對(duì)照組比較P＞0.05，無(wú)顯著差異，表明各主要臟器未發(fā)生顯著萎縮或退行性改變。但高劑量組大鼠中產(chǎn)生了消化性潰瘍和腫瘤，病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，腫瘤組織細(xì)胞呈卵圓形，有典型的濾泡中心細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，疑為腸黏膜淋巴瘤。銀杏葉提取物中含有銀杏酸，它是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的潛在致敏物質(zhì)，可引起消化道黏膜過(guò)敏反應(yīng)，降低黏膜屏障作用，導(dǎo)致消化性潰瘍。但存在于銀杏葉提取物中致使腫瘤形成的具體毒性成分，尚待研究。余啟枝等[2]證實(shí)對(duì)犬每日按80 mg/kg靜脈滴注3個(gè)月，腎臟部分腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性、空泡變性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠長(zhǎng)期大劑量使用銀杏葉提取物，能降血脂、抗血栓形成，但有可能引起消化性潰瘍與腫瘤，同時(shí)可使多項(xiàng)血液學(xué)和血液生化指標(biāo)發(fā)生顯著改變。

[1] Zhinden S,Seiler CH.Phytotherapy in cardiovascular medicine[J]. Ther Umsch,2002,59(6):301-306.

[2] 余啟枝,王政榮,張同輝,等.注射用銀杏內(nèi)酯B毒性試驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥師,2011,14(11):1629-1632.

R282.71；R-33

：B

：1671-8194（2014）04-0055-02