盧 藝* 鄒良玉 褚曉凡 張 瑩 付學(xué)軍

（暨南大學(xué)第二臨床學(xué)院深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020）

依達(dá)拉奉對谷氨酸所致神經(jīng)干細(xì)胞損害的保護作用

盧 藝* 鄒良玉 褚曉凡 張 瑩 付學(xué)軍

（暨南大學(xué)第二臨床學(xué)院深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020）

目的 探討依達(dá)拉奉對谷氨酸所致神經(jīng)干細(xì)胞損害的保護作用及機制。方法 取大鼠13.5 d胚胎皮質(zhì)，提取神經(jīng)干細(xì)胞，分為谷氨酸處理組（500 μmol/L）、依達(dá)拉奉干預(yù)組（500 μmol/L谷氨酸+500 ng/mL依達(dá)拉奉）和正常對照組。谷氨酸及依達(dá)拉奉處理24 h后，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡高倍下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量；并對各組細(xì)胞作DAPI及TUNEL染色，計數(shù)陽性細(xì)胞。結(jié)果 與正常對照組比較，谷氨酸處理組細(xì)胞的數(shù)量減少（P＜0.05）；依達(dá)拉奉組細(xì)胞的數(shù)量較谷氨酸組明顯增多（P＜0.05）。谷氨酸處理組的TUNEL陽性細(xì)胞明顯多于正常對照組（P＜0.05），依達(dá)拉奉組的TUNEL陽性細(xì)胞明顯少于谷氨酸組（P＜0.05）。結(jié)論 依達(dá)拉奉通過拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對谷氨酸所致的神經(jīng)干細(xì)胞損害起到保護作用。

神經(jīng)干細(xì)胞；凋亡；依達(dá)拉奉

中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生缺血、缺氧引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡，由此釋放的谷氨酸會導(dǎo)致谷氨酸受體大量激活，鈣離子通過激活的谷氨酸受體大量流入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，其可導(dǎo)致更多的神經(jīng)細(xì)胞損害[1]。依達(dá)拉奉是有效的自由基清除劑，大量的臨床研究證實其可以改善急性缺血性腦卒中的神經(jīng)損害癥狀以及恢復(fù)期的日常生活能力。其作用機制主要為抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、減輕腦內(nèi)花生四烯酸引起的水腫[1,2]。但依達(dá)拉奉能否通過抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸的神經(jīng)損害目前尚無報道。本研究觀察依達(dá)拉奉對谷氨酸損害的神經(jīng)干細(xì)胞的抗凋亡作用，以探討依達(dá)拉奉神經(jīng)保護作用的多靶點機制。

1 材料與方法

1.1 材料

孕13.5 d的SD大鼠2只（廣東省實驗動物監(jiān)測所提供）。DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，N2、B27(Sigma公司)，BFGF（Sigma公司），6孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司)，TUNEL染色試劑盒(Roche公司)，Nestin抗體（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將2只孕13.5 d的SD大鼠吸入二氧化碳麻醉處死后，75 %酒精消毒腹部皮膚，取出12只胚胎，將胚胎置于DMEM溶液中，顯微鏡下取出胚胎皮層，置于15 mL離心管中，經(jīng)過反復(fù)的抽吸，得到懸浮的單細(xì)胞，將其種植于細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)條件為37 ℃、5 % CO2和95 %空氣、飽和濕度，用含B2、N27、BFGF(Basic Fibroblast Growth Factor堿性成纖維細(xì)胞生長因子)的DMEM人工培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯集接近滿瓶時，用0.05 %胰蛋白酶消化，離心，收集細(xì)胞。細(xì)胞鑒定，用神經(jīng)細(xì)胞特異免疫熒光染色檢測法測神經(jīng)干細(xì)胞特異性蛋白——巢蛋白（Nestin蛋白）。Nestin蛋白是第6類中間絲骨架蛋白，定位于干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，已被廣泛用作神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物。在培養(yǎng)基中，NSCs（神經(jīng)干細(xì)胞）呈球團狀懸浮生長，神經(jīng)上皮干細(xì)胞巢蛋白表達(dá)陽性[3,4]。證實所培養(yǎng)細(xì)胞中神經(jīng)干細(xì)胞占95 %以上后繼續(xù)實驗。將細(xì)胞均勻接種于6孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板，分為谷氨酸處理組、依達(dá)拉奉干預(yù)組和正常對照組，每個實驗組6個復(fù)孔。

1.2.2 細(xì)胞模型建立與處理

谷氨酸處理組和依達(dá)拉奉干預(yù)組的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入谷氨酸（終濃度為500 μmol/L），誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞損傷[5]。同時在依達(dá)拉奉干預(yù)組的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入依達(dá)拉奉（濃度為500 ng/mL）。正常對照組的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入等量的生理鹽水。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量觀察

各組細(xì)胞藥物處理后培養(yǎng)24 h，用光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯）高倍鏡下進行拍照，觀察5個視野，觀察細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量。

1.2.4 DAPI染色與TUNEL染色

各組細(xì)胞藥物處理后培養(yǎng)24 h，對各組細(xì)胞進行DAPI與TUNEL雜色。在熒光顯微鏡下觀察，觀察5個視野，計數(shù)高倍視野下DAPI與TUNEL染色陽性的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析及ANOVA檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 谷氨酸處理組、依達(dá)拉奉干預(yù)組及正常對照組神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量比較

結(jié)果顯示：谷氨酸組的細(xì)胞數(shù)量較正常對照組減少。依達(dá)拉奉組的細(xì)胞數(shù)量較谷氨酸組增多（圖1、表1）。

圖1 谷氨酸處理組、依達(dá)拉奉干預(yù)組及正常對照組神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量比較。①、③、⑤為10倍鏡下所見；②、④、⑥為40倍鏡下所見

表1 谷氨酸處理組、依達(dá)拉奉干預(yù)組及正常對照組神經(jīng)干細(xì)胞形數(shù)量比較

2.2 谷氨酸處理組、依達(dá)拉奉干預(yù)組及正常對照組TUNEL陽性細(xì)胞比較

DAPI與TUNEL染色分別用于標(biāo)記活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示：正常對照組出現(xiàn)少量TUNEL陽性細(xì)胞；與正常對照組比較，谷氨酸處理組TUNEL陽性細(xì)胞明顯增多（P＜0.05）；與谷氨酸處理組比較，依達(dá)拉奉組的TUNEL陽性細(xì)胞明顯少于谷氨酸組（P＜0.05）。見圖2、表2。

3 討 論

本實驗使用的DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料。當(dāng)DAPI可以透過完整的細(xì)胞膜與雙股DNA結(jié)合時，熒光顯微鏡觀測藍(lán)色至青綠色，示活細(xì)胞。TUNEL（原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)）基因組DNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在TdT(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)的催化下加上熒光素(FITC)標(biāo)記的dUTP。熒光顯微鏡觀測呈黃綠色，示細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)：興奮性氨基酸谷氨酸對于神經(jīng)干細(xì)胞有顯著的損傷作用，其損傷作用可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生，依達(dá)拉奉通過抑制谷氨酸誘導(dǎo)的凋亡過程達(dá)到保護神經(jīng)干細(xì)胞的作用。

腦缺血后細(xì)胞死亡是一個多通道的過程，興奮性氨基酸的過度活躍對于腦缺血后的細(xì)胞損傷有明顯的放大作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生缺血引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡，由此釋放的谷氨酸會導(dǎo)致谷氨酸受體大量激活，鈣離子通過激活的谷氨酸受體大量流入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，其可導(dǎo)致更多的神經(jīng)細(xì)胞損害[1]。但依達(dá)拉奉能否通過抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸的神經(jīng)損害目前尚無報道。研究發(fā)現(xiàn)在急性腦梗死發(fā)生后，大量的神經(jīng)干細(xì)胞在腦室下區(qū)出現(xiàn)，這些神經(jīng)干細(xì)胞的出現(xiàn)對于神經(jīng)修復(fù)意義重大[6-9]。但由于谷氨酸等興奮性氨基酸的過量釋放，導(dǎo)致大量神經(jīng)干細(xì)胞死亡，影響了腦組織的自然修復(fù)[5]。本研究證實了谷氨酸對于神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞毒性。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸對于神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞毒性源于谷氨酸對于神經(jīng)干細(xì)胞凋亡過程的誘導(dǎo)作用。

圖2 谷氨酸處理組、依達(dá)拉奉干預(yù)組及正常對照組TUNEL陽性細(xì)胞比較（DAPI染色用于標(biāo)記活細(xì)胞，在熒光顯微鏡鏡下顯示藍(lán)色至青綠色；TUNEL——原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)，用于標(biāo)記凋亡細(xì)胞，在熒光顯微鏡鏡下顯示黃綠色。圖①～⑨均為40倍鏡下所見）

表2 谷氨酸處理組、依達(dá)拉奉干預(yù)組及正常對照組TUNEL陽性細(xì)胞比較

依達(dá)拉奉是目前臨床試驗證明唯一有效的自由基清除劑。對于急性腦梗死，其通過捕獲自由基，抑制腦細(xì)胞(神經(jīng)細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞)的過氧化作用[10,11]，從而達(dá)到減輕腦水腫和腦組織損傷的作用。由于其獨特的清除自由基和減輕缺血再灌注的作用機制[12]，適應(yīng)證還擴大到心肌、腎臟和肺缺血再灌注，肝臟、腸缺血等。本課題組之前的研究[13]顯示，對谷氨酸作用損傷的神經(jīng)干細(xì)胞，依達(dá)拉奉可以抑制其caspase-3的表達(dá)，并減少細(xì)胞的受損的數(shù)量，但是否可以減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量尚未明確。在這個研究基礎(chǔ)上，本研究探討依達(dá)拉奉保護神經(jīng)干細(xì)胞的機制，以TUNEL染色作為確定凋亡細(xì)胞數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)。研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸組的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量減少細(xì)胞受到明顯損害。而依達(dá)拉奉干預(yù)組的細(xì)胞數(shù)量較谷氨酸組顯著增加，細(xì)胞損害較輕。TUNEL染色示依達(dá)拉奉干預(yù)組的凋亡細(xì)胞數(shù)量較谷氨酸組明顯減少。表明依達(dá)拉奉干預(yù)可以減輕谷氨酸氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)干細(xì)胞損傷，降低神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。結(jié)合之前的實驗結(jié)果，依達(dá)拉奉干預(yù)可抑制caspase-3的表達(dá)，阻斷細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少細(xì)胞的凋亡，而起到神經(jīng)保護的作用。

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Protective Effects of Edaravone on Neural Stem Cells Injury Induced by Glutamate

LU Yi, ZOU Liang-yu, CHU Xiao-fan, ZHANG Ying, FU Xue-jun
(Shenzhen People's Hospital of Second Clinical College of Jinan University, Shenzhen 518020, China)

Objective To investigate the protective effects of Edaravone on neural stem cells (NSCs) injury induced by Glutamate. Methods NSCs were cultured from 13.5 d SD rat embryo, and divided into 3 groups: Glutamate group (500 μmol/L), Edaravone group (500 μmol/L glutamate +500 ng/mL edaravone ) and control group. 24 h after treatment, number of NSCs were observed under an optical microscope. TUNEL staining positive cells were counted under fluorescence microscope. Results Compared with the control group, NSCs in the glutamate groups damaged severely and the NSCs number was significantly lower (P＜0.05);while in edaravone group, NSCs in the glutamate groups damaged wildly and the NSCs number was significantly higher than that in the glutamate group (P＜0.05). Compared with the control group, the number of TUNEL staining positive cell in the glutamate groups was significantly higher (P＜0.05);while in edaravone group, the number of TUNEL staining positive cell was significantly lower than that in the glutamate group (P＜0.05). Conclusion Edaravone has a protective effect against injury induced by Glutamate on NSCs via inhibition of the apoptosis process.

Neural stem cells; Apoptosis; Edaravone

R971

：B

：1671-8194（2014）04-0018-03

*通訊作者：E-mail:1049328794@qq.com