王 英，楊海燕，許文晶，胡 萍，高志卓，徐韶琳＊

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科，吉林長春130041；2.吉化總醫(yī)院眼科）

iASPP在壓力誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡中的表達(dá)及意義

王 英1，楊海燕1，許文晶1，胡 萍1，高志卓2，徐韶琳1＊

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科，吉林長春130041；2.吉化總醫(yī)院眼科）

目的觀察P53凋亡刺激蛋白（ASPP家族的抑制因子iASPP）在壓力誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC－5）凋亡中的表達(dá)及意義。方法將視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC－5細(xì)胞）分別在60mmHg和80mmHg壓力條件下培養(yǎng)48小時(shí)，MTT方法檢測細(xì)胞活力，細(xì)胞染色檢測凋亡，RT－PCR，WESTERN－BLOT檢測P53和iASPP基因的變化。結(jié)果隨著壓力的增加RGC－5細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡逐漸增加，P53基因表達(dá)增加，iASPP基因的表達(dá)下降。結(jié)論在壓力誘導(dǎo)的RGC－5細(xì)胞凋亡中iASPP表達(dá)下降可能使P53活性增加，促進(jìn)RGC－5細(xì)胞凋亡的發(fā)生，上調(diào)iASPP表達(dá)可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。

P53凋亡刺激蛋白；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；凋亡

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1589）

P53是調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）凋亡的重要蛋白。P53凋亡刺激蛋白家族的抑制因子（iASPP）為新近發(fā)現(xiàn)的一種重要P53抑制蛋白［1］。為探討iASPP在壓力誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC－5）凋亡中的作用，我們采用RT－PCR，WESTERN－BLOT方法檢測iASPP在壓力誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC－5）凋亡中表達(dá)水平并初步探討其意義，為青光眼視神經(jīng)保護(hù)治療新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）、胎牛血清（美國Hyclone公司）、兔抗鼠單克隆體P53（美國Santa公司），兔抗鼠多克隆抗體iASPP（美國Santa公司），PCR試劑盒（美國TaKa－Ra公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)RGC－5細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱。應(yīng)用胰蛋白酶每3－4 d消化傳代1次。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)期生長的RGC－5細(xì)胞，以8×103每孔密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，將RGC－5細(xì)胞分別在60mm－Hg，80mmHg壓力條件下培養(yǎng)48h，然后，每孔加入5mg／ml的MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h；吸除培養(yǎng)液；加入100μl DMSO終止反應(yīng)，570nm波長測定吸光度（A），計(jì)算不同壓力對(duì)RGC－5細(xì)胞的增殖抑制率。

1.4 細(xì)胞染色檢測細(xì)胞凋亡Hoechst33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，細(xì)胞毒性低。它在聚AT序列富集區(qū)與DNA結(jié)合，顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。RGC－5細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24h后，將RGC－5細(xì)胞分別在60mmHg，80mmHg壓力條件下培養(yǎng)48h，加入10mg／ml Hoe33342避光染色0.5h，然后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 半定量RT－PCR檢測RGC－5細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24h后，將RGC－5細(xì)胞分別在60mmHg，80mm－Hg壓力條件下培養(yǎng)48h，取1×105個(gè)RGC－5細(xì)胞，利用Trizol一步法提取總RNA。利用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。根據(jù)Genbank上的基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參GAPDH上游引物：5′－CATCAAGAAG GTGGTGAAGCAGG－3′；下游引物：5′－CCACCACCCTGTTGCT GTAGCCA－3′；擴(kuò)增內(nèi)參GADPH長度為206bp；iASPP上游引物：5′－GTGAAGGAGATGAACGACCCG－3′；下游引物：5′－AGTGCGACCCTTACCGCGAGG－3′，所擴(kuò)增的iASPP目的片段長度為821bp。P53上游引物：5′－ACAGGACCCTGTCACCGAGGA－3′，下游引物5′－GACCTCCGTCACCGAGACC－3′，所擴(kuò)增的P53片段長度303bp；以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用上述iASPP，P53引物和內(nèi)參GADPH引物分別行PCR。反應(yīng)體系為25μl（ddH2O 13μl；模板cDNA 5μl；10×Easy Taq Buffer 2.5μl；dNTP 2μl；上游引物1μl；下游引物1μl；Easy Taq DNA聚合酶0.5μl；Total 25μl）。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，剩余34個(gè)循環(huán)95℃變性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s；最后72℃延伸5min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)含花青素的1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并在紫外投射儀下進(jìn)行觀察、拍照，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.6 Western BlotRGC－5細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24h后，將RGC－5細(xì)胞分別在60mmHg，80mmHg壓力條件下培養(yǎng)48h，收集RGC－5細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞30min，于4℃，12 000r／min離心5min后取上清液，然后加上樣緩沖液并于沸水中煮5 min，以10%濃度的SDS－PAGE電泳分離。電泳完畢后，膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗（1∶1 000）4℃過夜。TBST液漂洗30min，加入過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫孵育30min，TBST液漂洗1 h，ECL染色。掃描獲得圖像。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件包完成。

2 結(jié)果

2.1 MTT方法檢測壓力對(duì)RGC－5細(xì)胞活力的影響MTT結(jié)果提示，隨著壓力的增加，RGC－5細(xì)胞的細(xì)胞活力下降，60mmHg壓力作用RGC－5細(xì)胞48h后使細(xì)胞活力下降17.7%，80mmHg壓力作用RGC－5細(xì)胞48h后使細(xì)胞活力下降23.4%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 細(xì)胞染色檢測細(xì)胞凋亡Hoe33342染色正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)常常發(fā)生改變，包括細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃染，顏色發(fā)白，核碎片、凋亡小體的形成。為了檢測壓力是否誘導(dǎo)RGC－5細(xì)胞凋亡，我們用Hoe33342對(duì)處理后的RGC－5細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，壓力可以誘導(dǎo)RGC－5細(xì)胞發(fā)生染色質(zhì)濃縮，凋亡小體形成，而且隨著壓力的增加，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象更加明顯，見圖1。2.3 RT－PCR為檢測iASPP，P53在壓力誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC－5）凋亡中表達(dá)水平，我們?cè)趍RNA水平和蛋白水平對(duì)其進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，60mmHg和80mmHg壓力作用RGC－5細(xì)胞48h后引起RGC－5細(xì)胞中iASPP的mRNA表達(dá)減少，P53的mRNA表達(dá)增加；蛋白表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平一致。綜上所述，壓力可以誘導(dǎo)RGC－5細(xì)胞發(fā)生凋亡，在凋亡過程中iASPP表達(dá)減少，P53表達(dá)增加，見圖2、3。

圖1 Hoe33342染色檢測RGC－5細(xì)胞在不同壓力下細(xì)胞凋亡變化

圖2 RT－PCR方法檢測RGC－5細(xì)胞在不同壓力下P53和iASPP的mRNA的表達(dá)

圖3 Western－blot方法檢測RGC－5細(xì)胞在不同壓力下P53和iASPP蛋白的表達(dá)

3 討論

青光眼是目前世界上主要不可逆性致盲眼病。青光眼導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。在眾多調(diào)控細(xì)胞凋亡的因素中，P53與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡關(guān)系密切［2］。

p53凋亡刺激蛋白（apoptosis stimulating protein of p53，ASPP）是2001年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白質(zhì)家族［3］，該家族成員包括ASPP1、ASPP2和iASPP 3個(gè)成員。ASPP1和ASPP2通過提高原凋亡基因的活力促進(jìn)p53依賴的細(xì)胞死亡。iASPP基因存在于從線蟲到人類等多種生物細(xì)胞內(nèi)，序列高度保守［4，5］。iASPP與同一家族的ASPP1、ASPP2功能相反，它可以與ASPP1和ASPP2競爭結(jié)合p53的結(jié)合位點(diǎn)，通過特異性抑制p53的促細(xì)胞凋亡功能而抑制凋亡，而增加iASPP表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，通過反義RNA技術(shù)或RNA干擾技術(shù)使iASPP基因表達(dá)沉默后，可以增加秀麗隱桿線蟲發(fā)生p53依賴的細(xì)胞凋亡［1］。Ariel等［7］報(bào)道，增加iASPP的表達(dá)可以減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突損傷引起的凋亡。減少iASPP基因的表達(dá)可以增加促凋亡基因Bax，PUMA的表達(dá)，可以引起細(xì)胞凋亡或者增加細(xì)胞對(duì)促凋亡藥物的敏感性，進(jìn)一步提示iASPP具有抗凋亡的作用［8－10］?？傊珹SPP家族與P53結(jié)合形成ASPP－P53復(fù)合物，作用于原凋亡基因啟動(dòng)子，ASPP的微小變化就可以引起P53結(jié)合DNA能力發(fā)生改變，從而影響p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

本研究結(jié)果顯示，壓力能誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。在正常培養(yǎng)的RGC－5細(xì)胞中，有P53和 iASPP基因的表達(dá)。隨著培養(yǎng)體系的壓力增加，P53表達(dá)呈上升趨勢，iASPP表達(dá)呈下降趨勢，P53和iASPP表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，提示它們?cè)趬毫φT導(dǎo)的RGC－5凋亡中起重要作用，它們可能參與了RGC－5的凋亡進(jìn)程，同時(shí)在壓力誘導(dǎo)的RGC－5凋亡中維持iASPP表達(dá)水平或使其表達(dá)上調(diào)可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。但是目前我們還需要對(duì)iASPP功能進(jìn)一步研究，才能揭示iASPP在整個(gè)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中的作用。

［1］Bergamaschi D，Samuels Y，O’Neil NJ，et al.IASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53conserved from worm to human［J］.Nat Genet，2003，33：162.

［2］Wilson AM，Morguette B，Abdouh M.ASPP1／2regulate P53－depedent death of retinal ganglion cells through PUMA and Fas／CD95activation in vivo［J］.J Neurosci，2013，33（5）：2205.

［3］Samuels－Lev Y，O’Connor DJ，Bergamaschi D，et al.ASPP proteins specifically stimulate the apoptotic function of p53［J］.Mol Cell，2001，8（4）：781.

［4］Ahn J，Byeon IJ，Byeon CH，et al.Insight into the structural basis of pro－and antiapoptotic p53modulation by ASPP proteins［J］.J Biol Chem，2009，284：13812.

［5］Bergamaschi D，Samuels Y，O’Neil NJ，et al.iASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53conserved from worm to human［J］.Nat Genet，2003，33：162.

［6］Cao L，Huang Q，He J，et al.Elevated expression of iASPP correlates with poor prognosis and chemoresistant in FIGO lb－Ⅱa squamous cell cervical cancer［J］.Cell Tissue Res，2013，352（2）：361.

［7］Ariel M，Vince A，Sanford L，et al.Inhibitor of apoptosis stimulating protein of p53（iASPP）is required for neuronal survival after axonal injury［J］.Plos One，2014，9（4）：e94175.

［8］Liu ZJ，Cai Y，Hou L，et al.Effect of RNA interference of iASPP on the apoptosis in MCF－7breast cancer cells［J］.Cancer Invest，2008，26：878.

［9］Liu H，Wang M，Diao S，et al.siRNA－mediated down－regulation of iASPP promotes apoptosis induced by etoposide and daunorubicin in leukemia cells expressing wild－type p53［J］.Leuk Res，2009，33：1243.

［10］Yun Cai，Shi Qiu，Xing Gao，et al.iASPP inhibits p53－independent apoptosis by inhibiting transcriptional activity of p63／p73on promoters of proapoptotic genes［J］.Apoptosis，2012，17：777.

The expression and significance of iASPP gene in the apoptosis of retinal ganglion cells induced by pressure

WANG

Ying，YANG Hai－yan，XU Wen－jing，et al.（The second Hospital of Jinlin University，Changchun130041，China）

ObjectiveThis study was to explore the expression of iASPP on pressure—induced apoptosis of cultured retinal ganglion cells（RGC－5cells）.MethodsThe RGC－5cells were cultured under the pressure of 60mmHg and 80mmHg for 48hours.Cell viability were determined by MTT assays.Cells apoptosis was determined by Hoe33342.The expression of iASPP and P53was determined by using semi—quantitative RT—PCR and Western blot respective.ResultsMTT assay showed that the RGC－5cells viability was decreased in a pressure—dependent manner.As the pressure was up，the apoptosis of RGC－5cells was increased，the expression of P53was elevated and the expression of iASPP was decreased.ConclusionThe reduced expression of iASPP gene may increase the activity of p53and promote the apoptosis of RGC－5cells under pressure.Enhancing expression of iASPP may play a role as a neuroprotect.

iASPP；RGC；apoptosis

R775.1

A

2013－11－25）

1007－4287（2014）10－1589－03

吉林省科技廳資助項(xiàng)目（20090460）

＊通訊作者