高忠梅 劉鄰渭 原 田 趙貝塔 李 旋

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，楊凌 712100）

石榴（Punica granatum L.）為石榴科石榴屬植物，原產(chǎn)于中亞，在我國(guó)亞熱帶及溫帶地區(qū)均有分布[1]。石榴既是生食鮮果，又可用于加工食品，而且它的各部分皆有保健和食療作用[2]。隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，石榴的種植面積不斷擴(kuò)大，加工產(chǎn)品層出不窮，但由于對(duì)石榴籽的認(rèn)識(shí)不足，大多以廢料棄之，造成了資源的巨大浪費(fèi)。研究表明，石榴籽油中含有豐富的多不飽和脂肪酸，具有較好的抗氧化性、抗癌、降血糖、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[3-8]，有極好的利用價(jià)值。但是，石榴栽培品種繁多，目前對(duì)它們之間的差異性研究還較少，加強(qiáng)這一研究已成為石榴籽油開發(fā)亟待完成的重要任務(wù)之一。由于我國(guó)的石榴栽培品種可以根據(jù)果實(shí)的特點(diǎn)主要分為白色甜味，紅色甜味和紅色酸味3種，本文選擇產(chǎn)于陜西臨潼的‘三白甜’、‘凈皮甜’和‘酸石榴’3個(gè)栽培品種的果實(shí)為這3種石榴的代表性材料，研究它們種籽的含油量、籽油的脂肪酸組成及籽油和其皂化產(chǎn)物的抗氧化活性，旨在豐富對(duì)石榴栽培品種籽油含量、組成和保健功能差異的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘三白甜’、‘凈皮甜’和‘酸石榴’石榴成熟果實(shí)：購于陜西臨潼。手工分離凈化出石榴籽，于50℃烘至恒重，粉碎后過60目篩，得石榴籽粉。

DPPH·和ABTS＋·、亞油酸：Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BL6-180A型超聲波清洗機(jī)：上海比郎儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司，色譜柱30 m×0.25 mm×0.25μm的毛細(xì)管柱；高速中藥粉碎機(jī)：浙江偉能達(dá)電器有限公司；7230G可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)有限公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海精密科學(xué)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 石榴籽油的提取[9]

準(zhǔn)確稱取5.0 g粉碎的石榴籽粉，裝入燒杯中，以沸程為60～90℃石油醚為浸提劑，在料液比1∶7（g／mL），溫度37～40℃，超聲波功率180 W，頻率40 Hz的條件下，超聲提取60 min。提取結(jié)束后，抽濾分離溶劑與殘?jiān)?，石油醚洗滌殘?jiān)?～3次，合并濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸餾，回收溶劑，得到的石榴籽油在105℃干燥至恒重后，稱重計(jì)算出油率。試驗(yàn)重復(fù)3次，石榴籽油出油率按下式計(jì)算：

式中：W為出油率／%；m1為提取石榴籽油質(zhì)量／g；m2為石榴籽粉質(zhì)量／g。

1.3.2 石榴籽油的皂化[10]

稱取5.0 g石榴籽油與1.0mol／L的氫氧化鉀乙醇溶液在煮沸回流條件下進(jìn)行皂化1 h，然后用乙醚萃取不皂化物，皂化液最后用蒸餾水定容至250 mL，得到20 mg／mL的皂化產(chǎn)物溶液（皂化產(chǎn)物的含量以皂化前所加入的石榴籽油計(jì)量）。

1.3.3 脂肪酸組成的GC-MS分析

采用日本島津公司QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，色譜柱為30 m×0.25 mm×0.25μm的毛細(xì)管柱，內(nèi)涂SE-54。

1.3.3.1 甲酯化方法[11-12]

稱取20 mg石榴籽油，置于具塞試管中，加入1.5 mL石油醚（30～60℃）與苯（1∶1）的混合液，振搖使油脂溶解后，加入2 mL的0.4 mol／L的KOH-甲醇溶液，混勻后在室溫下靜置10 min，再加入12 mL水，靜置取上清液，進(jìn)行色譜分析。

1.3.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件[11-14]

載氣（He），流速 1.0 mL／min，壓力 109.8 kPa，進(jìn)樣量1μL；進(jìn)樣溫度：250℃；接口溫度：270℃；升溫程序：150℃以10℃／min升至220℃，再從220℃以8℃／min升至300℃，300℃保持3 min；分流比60∶1。質(zhì)譜電離方式EI；離子源溫度200℃；電子能量70 eV；加速電壓6 kV；分辨率800；質(zhì)量掃描范圍m／z 40～500；溶劑延時(shí)3 min。

1.3.4 石榴籽油清除自由基能力測(cè)定

1.3.4.1 DPPH·的清除[15]

在3mL 0.2mmol／L的DPPH·溶液中加入不同濃度石榴籽油乙醇溶液各3 mL（空白對(duì)照用等量95%乙醇代替），用力搖勻，于室溫下反應(yīng)30 min，以95%的乙醇溶液調(diào)零，測(cè)定混合液在517 nm處的吸光值A(chǔ)，每個(gè)試樣重復(fù)3次。

清除率 I＝（A1-A＋A0）／A1×100%

式中：A為樣品吸光度；A0為本底吸光度；A1為樣品空白吸光度。

1.3.4.2 ABTS＋·的清除[16-18]

將5 mL的7 mmol／L ABTS＋·和88μL的140 mmol／L過硫酸鉀混合，在室溫避光的條件下反應(yīng)12～16 h，然后用無水乙醇將其稀釋成在734 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.70±0.02的工作液。向4.0 mL的ABTS＋·工作液中加入不同濃度石榴籽油乙醇溶液各0.5 mL（空白對(duì)照用等量無水乙醇代替），搖勻，室溫下反應(yīng)30min，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，每個(gè)試樣做3次平行樣，取平均值。

ABTS＋·清除率 I＝（A2-A1＋A0）／A2×100%

式中：A2為空白對(duì)照反應(yīng)后的吸光度，A1為樣液反應(yīng)后的吸光度，A0為樣液本底的吸光度。

1.3.5 石榴籽油皂化產(chǎn)物的抗氧化性測(cè)定

1.3.5.1 ·OH的清除[19]

配制各石榴籽油皂化液質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg／mL，按表1從順序依次加入試劑和樣液。搖勻后將反應(yīng)體系置于37℃恒溫水浴鍋中，準(zhǔn)確反應(yīng)1.5 h后立即取出并迅速測(cè)定其在536 nm的吸光度（蒸餾水作參比，便于提高精度），每個(gè)試樣均做3次平行。

式中：A0為不含樣品和雙氧水的吸光度；A1為不含樣品只含雙氧水的吸光度；A為含有樣品和雙氧水的吸光度。

表1 清除·OH試驗(yàn)方法中試劑和樣液的加量

1.3.5.2 β-胡蘿卜素／亞油酸漂白法[20-21]

取4 mL 1 mg／mL的β-胡蘿卜素的氯仿溶液，加入40 mg亞油酸及400 mg Tween-40，45℃旋轉(zhuǎn)蒸餾4 min，然后緩慢加入100 mL蒸餾水，并劇烈振蕩，得乳狀液。取1 mL不同濃度的皂化液與4 mL乳狀液于試管中，于470 nm波長(zhǎng)下測(cè)“0”時(shí)刻的A值，然后將所有試管置于50℃恒溫水浴中，每隔30 min測(cè)1次A值，對(duì)照管以1 mL水代替皂化液。同時(shí)另取一燒瓶，不加β-胡蘿卜素溶液，其他同前，作空白調(diào)零用。

β-胡蘿卜素漂白的抑制率 I＝[1-（A0-A180）／（A0′-A180′）]×100%

式中：A0和A0′為“0”時(shí)刻樣品和對(duì)照的吸光度；A180和A180′為180 min后樣品和對(duì)照的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel統(tǒng)計(jì)和繪圖所得，數(shù)據(jù)為3次“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴籽油的出油率

趙文英等[22]認(rèn)為石榴籽油的提取率與浸提溶劑及提取方法有關(guān)，其中溶劑對(duì)提取率的影響比提取方法大。結(jié)果表明，在相同條件下提取石榴籽油，不同品種石榴籽出油率具有較大差別，酸石榴出油率（15.94±0.003）% ＞凈皮甜出油率（15.25±0.005）%＞三白甜出油率（8.39±0.007）%。

2.2 3種栽培品種石榴籽油脂肪酸差異性

不同品種石榴籽油脂肪酸組成見表2。通過GC-MS分析，3種石榴籽油中均主要含有10種脂肪酸成分，且石榴酸含量最高。苗利利等[14]認(rèn)為提取方法對(duì)石榴籽油中石榴酸含量影響較大，超聲波輔助提取和微波輔助提取比索氏抽提所得石榴籽油的石榴酸含量要高，趙淑娟等[12]認(rèn)為甲酯化方法對(duì)石榴酸和其他脂肪酸含量也有較大影響，堿法甲酯化優(yōu)于酸法甲酯化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，石榴品種也對(duì)石榴籽油中石榴酸及其他脂肪酸含量有影響，3種石榴籽油的石榴酸相對(duì)含量排序?yàn)镾BT（77.51%）＞JPT（74.58%）＞SSL（68.98%），且 3個(gè)供試栽培品種籽油的不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高達(dá)90%以上。

表2 3種栽培品種石榴籽油脂肪酸的組成

2.3 石榴籽油對(duì)自由基的清除效果

2.3.1 清除DPPH·的效果

3種栽培品種石榴籽油對(duì)DPPH·的清除效果如圖1所示。

圖1 不同濃度石榴籽油對(duì)DPPH·的清除作用

由圖1可知，石榴籽油對(duì)DPPH·的清除率隨著籽油試樣濃度的增大而增大，且在相同濃度下3種石榴栽培品種的籽油對(duì)這種自由基清除率的大小順序?yàn)镾BT＞JPT＞SSL。這說明供試石榴籽油都具有良好的DPPH·清除能力，但彼此存在一定差異。

2.3.2 清除ABTS＋·的效果

3種栽培品種石榴籽油對(duì)ABTS＋·的清除效果如圖2所示。

圖2 不同濃度石榴籽油對(duì)ABTS＋·的清除作用

由圖2可知，石榴籽油對(duì)ABTS＋·的清除率隨著籽油試樣濃度的增大而增大，且在相同濃度下3種石榴栽培品種的籽油對(duì)這種自由基清除率的大小順序?yàn)镾BT＞JPT＞SSL。這說明供試石榴籽油都具有良好的ABTS＋·清除能力，但彼此存在一定差異。

2.4 石榴籽油皂化液的抗氧化性

由于石榴籽油不能溶于水，即使是其乙醇溶液，加入水體系試劑也形成渾濁，所以很難用其他常用的體外測(cè)定方法進(jìn)一步直接考察石榴籽油的抗氧化功能。為此，本文將石榴籽油皂化后，形成溶于水的脂肪酸鹽試樣來間接進(jìn)一步考察石榴籽油的抗氧化性。

2.4.1 清除·OH的效果

3種栽培品種石榴籽油皂化液對(duì)·OH的清除效果如圖3所示。

圖3 不同濃度石榴籽油皂化液對(duì)·OH的清除作用

由圖3可知，石榴籽油對(duì)·OH的清除率隨著籽油試樣濃度的增大而增大，且在相同濃度下3種石榴栽培品種的籽油對(duì)這種自由基清除率的大小順序?yàn)镾BT＞JPT＞SSL。這說明供試石榴籽油脂肪酸鹽具有良好的·OH清除能力，但彼此存在顯著差異。

2.4.2 抑制β-胡蘿卜素／亞油酸體系漂白的效果

3種栽培品種石榴籽油皂化物溶液抑制β-胡蘿卜素／亞油酸體系漂白的效果如圖4所示。

圖4 不同濃度石榴籽油皂化液對(duì)β-胡蘿卜素漂白的抑制率

由圖4可知，石榴籽油皂化物溶液對(duì)β-胡蘿卜素漂白抑制率隨著皂化液試樣濃度的增大而增大，且在相同濃度下3種石榴栽培品種的抑制率順序?yàn)镾BT＞JPT＞SSL。由于一種物質(zhì)對(duì)β-胡蘿卜素漂白抑制率的大小可以反映該物質(zhì)抗脂質(zhì)氧化的活性高低，因此，本文將該抑制率又稱為抗氧化活性。

3 結(jié)論

3種供試鮮石榴石榴籽的出油率及油脂脂肪酸含量隨著品種的不同具有較大差異，石榴酸為石榴籽油的主要脂肪酸，且其含量順序?yàn)镾BT（77.51%）＞JPT（74.58%）＞SSL（68.98%）。

3種石榴籽油均具有較強(qiáng)的清除DPPH·及ABTS＋·自由基能力，石榴籽油皂化后的皂化產(chǎn)物溶液（溶于水）具有良好的清除自由基及抑制β-胡蘿卜素／亞油酸體系漂白的效果，且它們的抗氧化性排序均為：SBT＞JPT＞SSL，這和3種供試石榴籽油的石榴酸含量排序相同，表明石榴籽油的抗氧化能力與其品種及石榴酸含量有關(guān)。

石榴籽油的含量、脂肪酸組成和石榴酸含量均存在明顯的品種差異，石榴籽油和其皂化液都表現(xiàn)出良好的抗氧化性，且石榴酸是其主要活性物，這為石榴籽油在保健，醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)的開發(fā)利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

[1]張潤(rùn)光，吳倩，張亮，等.石榴籽油的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2012（6）：26-29

[2]苑兆和，尹春雷，朱麗琴，等.石榴保健功能的研究進(jìn)展[J].山東林業(yè)科技，2008（1）：91-93

[3]苗利利，仇農(nóng)學(xué)，龐?？?石榴籽油的理化性質(zhì)及清除自由基能力研究[J].食品工業(yè)科技，2010（1）：108-110

[4]阿依姑麗·艾合麥提，韓海霞，戴小華，等.石榴籽油的提取及其體外抗氧化作用的研究[J].西北藥學(xué)雜志，2011，26（1）：37-39

[5]Kim N D，Mehta R，Yu Weiping，et al.Chemo preventive and adjuvant therapeutic potential of pomegranate for human breast cancer[J].Breast Cancer Research and Treatment，2002，71（3）：203-217

[6]Albrecht M，Jiang Wenguo，James K D，et al.Pomegranate extracts potently suppress proliferation，xenograft growth and invasion ofhuman prostate cancer cells[J].JournalofMedical Food，2004，7（3）：274-283

[7]李雪梅，張穎，王楓.石榴籽油對(duì)高脂膳食大鼠血脂的影響[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，20（5）：39-41

[8]Schubert SY，Lansky E P，Neeman I.Antioxidantand eicosanoid enzyme inhibition properties of pomegranate seed oil and fermented juice flavonoids[J].Journal of Ethno pharmacology，1999，66（1）：11-17

[9]張立華，張?jiān)?，劉靜，等.石榴籽油超聲波輔助萃取工藝研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24（4）：82-86

[10]翟愛華，謝宏.糧油檢驗(yàn)[M].北京：科學(xué)出版社，2011：140-142

[11]苗利利，鄧紅，仇農(nóng)學(xué).石榴籽油的超聲波輔助提取工藝及GC-MS分析[J].食品工業(yè)科技，2008，29（5）：226-228

[12]趙淑娟，葉天，敬璞.石榴籽油中的石榴酸分析方法研究[J].食品工業(yè)，2012，33（7）：89-91

[13]張寧，姜明華，徐凌川.CO2超臨界萃取石榴籽油成分分析[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，33（2）：161-162

[14]苗利利，仇農(nóng)學(xué)，龐?？?，等.不同提取方法對(duì)石榴籽油中石榴酸含量的影響[J].中國(guó)油脂，2009，34（3）6-8

[15]Amin A，Razieh Y.Antioxidant and free radical scavenging potential of Achillea santolina extracts[J].Food Chemistry，2007，104（1）：21-29

[16]Ye Chunlin，DaiDehui，HuWeilian.Antimicrobialand antioxidant activities of the essential oil from onion（Allium cepa L.）[J].Food Control，2013，（30）：48-53

[17]Cristina D A，JoséA R H，F(xiàn)rancisco JM.Assessing the antioxidant activity ofmelanoidins from coffee brews by different antioxidant methods[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005（53）：7832-7836.

[18]韓光亮，李翠梅，Eduardo C，等.改良的 ABTS＋·法及其在優(yōu)化抗氧化活性物質(zhì)提取中的應(yīng)用[J].衛(wèi)生研究，2004，33（5）：620-622.

[19]張繼，孔浩，張芳.植物油清除自由基能力研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（9）：3521-3523

[20]Perumal S，Klaus B.The antioxidant and free radical scavenging activities of processed cowpea（Vigna unguiculata（L.）walp.）seed extracts[J].Food Chemistry，2007，101（1）：10-19

[21]Duan Xiaojuan，ZhangWeiwei，Li Xiaoming，et al.Evaluation of antioxidant property of extractand fractions obtained from a red alga，Polysiphonia urceolata[J].Food Chemistry，2006，22（95）：37-43

[22]趙文英，崔波，朱政，等.提取方法對(duì)石榴籽油提取率及抗氧化性的影響[J].中國(guó)林福特產(chǎn)，2010（4）：4-6.