付亭亭 綦文濤 李愛科， 劉建學(xué) 梁新曉 贠婷婷 王永偉

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，洛陽 471000）

（國家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037）

豆粕中的棉籽糖和水蘇糖分別占大豆可溶性糖類的5.2%～15.8%和12.1%～35.2%[1]，因其能夠引起動物尤其是幼齡動物的脹氣、腹瀉、腹痛等癥狀[2]，同時很難通過簡單的加熱或加工除去[3]，而極大的限制了豆粕的推廣應(yīng)用。目前，公認(rèn)最有前景的方法是通過酶降解或微生物發(fā)酵等生物技術(shù)手段進(jìn)行消減或者徹底去除。微生物發(fā)酵豆粕時所產(chǎn)生的豐富酶系，不僅能將豆粕中的水蘇糖和棉籽糖降解為可供微生物利用的單糖[4]，而且也可將豆粕中的其他抗?fàn)I養(yǎng)因子降解。因此，相關(guān)研究也越來越受到關(guān)注。目前豆粕中棉籽糖和水蘇糖的常用檢測方法多為HPLC法，但已報道的HPLC法還存在檢測時間較長，精度不夠等問題，不適合于日?？焖贆z測。除此之外，發(fā)酵豆粕還存在很多的不足，如在動物上的應(yīng)用研究還不夠細(xì)致，發(fā)酵產(chǎn)品的差異也比較大，所采用菌種多種多樣，但功效不明確等。因此，優(yōu)良菌種的篩選，不同菌種的抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效果檢驗和標(biāo)準(zhǔn)化的產(chǎn)品評價方法仍是發(fā)酵豆粕下一步研究的重點。

基于上述問題，本研究在建立準(zhǔn)確、快速水蘇糖和棉籽糖檢測方法的基礎(chǔ)上，以豆粕為來源，通過固態(tài)發(fā)酵的方法，以微生物的增殖活性、發(fā)酵豆粕的感官評價及水蘇糖和棉籽糖的降解情況等為評價指標(biāo)，篩選出具有應(yīng)用潛力的優(yōu)良菌株和復(fù)配方案，為發(fā)酵豆粕的準(zhǔn)確評價和穩(wěn)定產(chǎn)品的開發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

YPD培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，蒸餾水 1 L，115℃滅菌25 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L，121℃滅菌25 min。

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，酵母浸膏5 g，磷酸鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，無水乙酸鈉 5 g，Tween 80 1 mL，硫酸鎂 0.58 g，硫酸錳 0.25 g，蒸餾水1 L，pH 6.2～6.8，115℃滅菌30 min。

牛肉膏蛋白胨酪蛋白選擇培養(yǎng)基：氯化鈉5 g，干酪素3 g，10%乳酸適量，瓊脂20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 L，121℃滅菌25 min。

棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)品：經(jīng)科宏達(dá)；水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品：TIC公司，2種糖純度均大于98%。乙腈為色譜純試劑：Dikma公司；Milli-Q50超純水處理器：Millipore公司。

UV-2102紫外-可見分光光度計：美國尤尼柯儀器有限公司；PRX-350B智能人工氣候箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；HSP-400生化培養(yǎng)箱：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；Mini Spain高速離心機：美國Eppendorf；粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；60目分樣篩：浙江上虞市公路儀器廠；高效液相色譜系統(tǒng)：Waters。

1.2 試驗方法

1.2.1 HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖方法的建立

1.2.1.1 色譜條件的建立

采用Waters 2410示差折光檢測器，色譜柱采用日本島津公司Inertsil NH2柱（4.6 mm×250 mm i.d.，5μm）；流動相為乙腈∶水為 65∶35（V／V）；流速1.0 mL／min；柱溫35℃，檢測器溫度為40℃。

1.2.1.2 水蘇糖和棉籽糖檢測線性范圍的確定

配制 2.00、2.50、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00 mg／mL的棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和4.00、8.00、10.00、12.00、16.00、20.00、40.00 mg／mL的水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。根據(jù)測定的峰面積（A，mV／s）和對應(yīng)的糖質(zhì)量濃度（c，mg／mL）進(jìn)行線性回歸，分別得到棉籽糖和水蘇糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.1.3 HPLC測定

吸取10.50 mg／mL的水蘇糖和2.00 mg／mL的棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，以測得的峰面積（A，mV／s）為指標(biāo)，測定檢測方法的重現(xiàn)性[5]。

取供試樣品5份，每份1.50 g，按照樣品提取工藝處理，檢測所建色譜條件用于樣品檢測時的可重復(fù)性[6]。

1.2.1.4 HPLC檢測法的回收率試驗

取已知含量的樣品1.00 g，分別定量加入水蘇糖和棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)品，按照樣品處理方法處理樣品，進(jìn)樣測定并計算，計算水蘇糖和棉籽糖的平均加樣回收率。

1.2.2 菌種的篩選和鑒定

1.2.2.1 菌種的來源

本試驗所使用的菌種一部分來源于實驗室保藏菌種，另一部分從豆粕中篩選而來。

1.2.2.2 菌種的篩選

取豆粕樣品10.0 g，放入帶有玻璃珠的三角瓶中，加90mL生理鹽水，震搖20 min，使樣品與生理鹽水充分混合均勻。之后將懸液制成10-9～10-1不等的稀釋度樣品液，然后將其涂布在牛肉膏蛋白胨酪蛋白培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1～3 d，觀察[7]。從其中挑選出能夠在培養(yǎng)基上生長且能夠產(chǎn)生透明水解圈的菌株。以產(chǎn)蛋白酶能力為指標(biāo)，篩選出可用菌株。

1.2.2.3 菌種的鑒定

通過顯微鏡下菌體觀察、芽孢檢測以及16S rRNA序列分析來鑒定菌種名稱。

1.2.2.4 菌種的生長曲線測定方法

將菌種分別從斜面固體培養(yǎng)基接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，并于30℃（酵母菌）、37℃（枯草芽孢桿菌和屎腸球菌）200 r／min搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測定培養(yǎng)液的OD600，使用未接種的培養(yǎng)液做空白對照。

1.2.3 豆粕的固態(tài)發(fā)酵工藝

準(zhǔn)確稱取豆粕 45 g，以 9∶0.5∶0.5（豆粕∶玉米粉∶麩皮）的比例加入麩皮和玉米粉，以15%的接種量，料水比為1∶0.8，30℃發(fā)酵48 h后，50℃干燥3 h，粉碎過篩即可。

1.2.4 發(fā)酵豆粕感官分析

豆粕經(jīng)過上述條件發(fā)酵后，通過眼觀、鼻聞等方法對發(fā)酵豆粕的顏色、氣味及黏度。稱取10.00 g樣品于平皿中進(jìn)行感官評價，評價標(biāo)準(zhǔn)參考 NY／T 22182012中對發(fā)酵豆粕中的要求。

1.2.5 樣品處理

稱取過60目篩的樣品0.15 g，準(zhǔn)確至0.000 1 g，加入50%的乙腈1.5mL，超聲輔助提取45 min，溫度為40℃。以4 000 r／min離心10 min，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾[8]。用 HPLC分析其中水蘇糖和棉子糖的含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用EXCEL和SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理，各組間均數(shù)差異性比較采用的是One-Way ANOVA方法，顯著性水平P＜0.05。水蘇糖和棉子糖含量分析采用的是Waters公司Empower 2色譜工作站，測定出目標(biāo)峰峰面積之后，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖方法的建立

2.1.1 水蘇糖和棉籽糖HPLC檢測方法的有效性

圖1為水蘇糖和棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖，由圖1可見本研究所建立的色譜條件可以使水蘇糖和棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品有效分離，分離效果良好，二者的出峰時間（Retention Time，RT）分別為12.6、8.6 min，整個分析過程可在15 min內(nèi)完成。

圖1 水蘇糖和棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.1.2 HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖的線性范圍

以峰面積（A，mV／s）為橫坐標(biāo)，濃度（c，mg／mL）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到圖2和圖3。圖2和圖3分別為水蘇糖和棉子糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，分別得到水蘇糖和棉籽糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

圖2 水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

水蘇糖線性方程：c＝8×10-6A＋0.380

棉籽糖線性方程：c＝9×10-6A＋0.269

結(jié)果表明：棉籽糖的檢測范圍為2.00～10.00 mg／mL，水蘇糖的檢測范圍為 4.00～40.00 mg／mL，且棉籽糖和水蘇糖在其檢測范圍內(nèi)線性良好。

2.1.3 HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖的精密度

吸取10.50 mg／mL的水蘇糖和2.00 mg／mL的棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次[9]，以測得的峰面積（A，mV／s）為指標(biāo)，得水蘇糖的 RSD為 0.89%（n＝5），棉籽糖的 RSD為0.81%（n＝5）。

2.1.4 HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖的回收率

取已知含量的樣品1.00 g，分別定量加入水蘇糖和棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)品，按照樣品處理方法處理樣品，進(jìn)樣測定并計算，得出水蘇糖的平均加樣回收率為95.68%，棉籽糖的平均加樣回收率為95.08%，試驗結(jié)果見表1。

表1 方法回收率（n＝5）

由以上數(shù)據(jù)可以得出，本試驗所采用的HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖方法適合于水蘇糖和棉籽糖的準(zhǔn)確、快速定量。

2.2 菌種的篩選和鑒定

2.2.1 菌種的篩選

優(yōu)良的菌種是固態(tài)發(fā)酵豆粕的基礎(chǔ)，而菌株的蛋白酶活性的高低是利用其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵所要考慮的首要因素。本研究以產(chǎn)蛋白酶能力和固態(tài)發(fā)酵時微生物細(xì)胞的增殖能力為考核指標(biāo)，通過稀釋平板涂布法篩選出具有應(yīng)用潛力的發(fā)酵豆粕菌株。表2為初步篩選出的6株菌的菌落形態(tài)。其中菌株A1和B1呈光滑圓潤的乳白色菌落形態(tài)，并能夠形成顯著的蛋白水解圈（如圖4），具有很好的蛋白酶生成能力。

表2 分離純化菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖4 A1和B1產(chǎn)生的水解圈

圖5 A1和B1的生長曲線

以牛肉膏培養(yǎng)基為培養(yǎng)基質(zhì)，每隔2小時取樣，繪制了A1和B1的生長曲線。由圖5可知，菌株A1和B1在液體培養(yǎng)基中生長的延遲期均較短，且生長速率較高。其中，A1和B1的對數(shù)生長期分別在2～20 h和2～14 h，生長穩(wěn)定期分別為20 h和14 h。因此，A1和B1的最佳接種齡分別為16～20 h和10～14 h。

為了進(jìn)一步考察A1和B1能否充分的利用豆粕生長繁殖，對這兩株菌發(fā)酵豆粕前后的活菌數(shù)進(jìn)行了測定，結(jié)果見圖6。

圖6 A1和B1發(fā)酵豆粕前后活菌數(shù)

從圖6可以得出，發(fā)酵前后菌株A1和B1的活菌數(shù)分別增加了3.6倍和3倍。因此，所篩得菌株均可以利用豆粕作為底物生長繁殖。

2.2.2 菌種的鑒定

將篩得菌株的16S rRNA基因序列分析測序結(jié)果通過BLAST與GenBank里收錄的細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)菌株A1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）同源相似度達(dá)到了99.0%；B1與屎腸球菌（Enterococcus faecium）的同源相似度達(dá)到了99.0%。根據(jù)兩株細(xì)菌的顯微形態(tài)及菌落形態(tài)，結(jié)合16S rRNA序列分析，確定菌株A1和B1分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和屎腸球菌（Enterococcus faecium）。

A1的16S rRNA基因序列分析部分堿基片段如圖7所示。

圖7 A1菌株部分DNA序列

B1的16S rRNA基因序列分析部分堿基片段如圖8所示。

圖8 B1菌株部分DNA序列

2.3 不同菌種發(fā)酵豆粕的感官評價與水蘇糖、棉子糖降解分析

由于混合菌種發(fā)酵同時具有提高蛋白含量，彌補單一菌種發(fā)酵的不足，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子等多重優(yōu)點，因此在發(fā)酵豆粕領(lǐng)域混合菌種發(fā)酵較單一菌種發(fā)酵更具有優(yōu)勢。本研究采用實驗室保存菌株（包括產(chǎn)朊假絲酵母（CU1）、8605酵母粉）和篩選菌株枯草芽孢桿菌和屎腸球菌分別進(jìn)行了豆粕單一菌種和混合菌種固態(tài)發(fā)酵，在對發(fā)酵后產(chǎn)品進(jìn)行感官評價的基礎(chǔ)上，利用本研究所建立方法，測定了發(fā)酵后豆粕中的水蘇糖和棉籽糖的降解情況，結(jié)果如表3所示。

通過感官性狀的分析發(fā)現(xiàn)，本試驗所采用的菌株發(fā)酵豆粕后均為黃色或淺黃色。屎腸球菌或產(chǎn)朊假絲酵母單一菌種發(fā)酵后豆粕均具有酸香味，兩者混合發(fā)酵后酸香味更加濃郁。由于篩選的菌種屎腸球菌和枯草芽孢桿菌均有高產(chǎn)蛋白酶活性，因此發(fā)酵后豆粕黏度較大。產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌以及屎腸球菌混合發(fā)酵后，豆粕不僅顏色金黃，酸香味濃郁，而且黏度較大，符合優(yōu)質(zhì)發(fā)酵豆粕的感官要求。

表3 豆粕及發(fā)酵豆粕的產(chǎn)品評價結(jié)果／%（n＝5）

在對發(fā)酵豆粕進(jìn)行感官評價之后，使用上述建立色譜條件，對發(fā)酵豆粕中的水蘇糖和棉籽糖進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆粕中的水蘇糖和棉籽糖能與樣品中的其他組分在20 min內(nèi)有效分離，且峰形較好，如圖9和圖10所示。所得RSD為1.95%（n＝5），表明所建檢測方法可以準(zhǔn)確的用于發(fā)酵豆粕中水蘇糖和棉子糖的檢測分析。

圖9 發(fā)酵前樣品色譜圖

圖10 發(fā)酵后樣品色譜圖

從表3中可知，酵母菌CU1和8605單一菌種發(fā)酵后可將豆粕中的水蘇糖和棉籽糖完全降解。這一結(jié)果與 Cavazzoni等[10]的研究結(jié)果一致。Cavazzoni證明了假絲酵母能夠在以棉籽糖為唯一碳源的礦物培養(yǎng)基中產(chǎn)生A和B 2種α-半乳糖苷酶，其中A型在pH和溫度適宜的情況下能將培養(yǎng)基中的棉籽糖完全降解。產(chǎn)朊假絲酵母混合枯草芽孢桿菌或屎腸球菌所得發(fā)酵豆粕具有良好的感官性狀，并且其中水蘇糖和棉子糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子完全降解。與之相比，酵母8605在與枯草芽孢桿菌和屎腸球菌混合發(fā)酵時，能將水蘇糖完全降解，棉籽糖部分降解。這可能是因為枯草芽孢桿菌或屎腸球菌競爭抑制了酵母的生長，而枯草芽孢桿菌的生長繁殖過程不需要糖的存在，其對糖的利用率很低，因此當(dāng)酵母與枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵豆粕時，對低聚糖的降解沒有單純使用酵母發(fā)酵的效果好。

屎腸球菌發(fā)酵豆粕的過程中，優(yōu)先利用較容易吸收的蔗糖，之后會部分的分解利用水蘇糖[11]，在整個發(fā)酵過程中，隨著屎腸球菌的生長繁殖培養(yǎng)基的pH會逐漸減少到5.0以下，而Mital等[12]證明了乳酸菌所產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶類的活性范圍在pH 4.5～8.0，這就導(dǎo)致了豆粕中的水蘇糖和棉籽糖被部分分解，而不是被完全降解。

由于多菌種混和發(fā)酵豆粕后，不同微生物產(chǎn)生的混合酶系豐富，能將豆粕中大分子的蛋白降解為小分子的寡肽，使豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制因子、脲酶、水蘇糖、棉籽糖以及抗原蛋白等被完全降解，顯著提高了豆粕的適口性和消化率[13]。然而多菌種混合發(fā)酵的綜合作用是單一菌種所不能完成的，因此混合菌種發(fā)酵豆粕更具有應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

3.1 建立了20 min內(nèi)能將發(fā)酵豆粕中的水蘇糖和棉籽糖準(zhǔn)確檢測HPLC法，在該方法下水蘇糖和棉籽糖的檢測限分別為4.00～40.00 mg／mL和2.00～10.00 mg／mL，平均加樣回收率分別為95.68%和95.08%，滿足對豆粕中水蘇糖和棉籽糖的檢測要求，適合于發(fā)酵豆粕的日常檢測。

3.2 篩選出了具有發(fā)酵豆粕應(yīng)用潛力的枯草芽孢桿菌和屎腸球菌。并對不同菌種單一菌種和混合菌種發(fā)酵后豆粕中水蘇糖和棉籽糖的降解效果進(jìn)行了評價，結(jié)果表明酵母菌CU1和8605單菌發(fā)酵后可將豆粕中的水蘇糖和棉籽糖完全降解?？莶菅挎邨U菌和屎腸球菌單一菌種發(fā)酵后可將水蘇糖和棉籽糖部分降解。

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