白朋等

摘 要：采用稀釋平板法對轉(zhuǎn)AmGS抗寒基因紅葉石楠的土壤微生物的數(shù)量與種類進行測定，并對細菌、真菌菌株培養(yǎng)性狀進行了分析，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)AmGS基因紅葉石楠根際土壤與對照組相比，細菌和真菌的種類和數(shù)量沒有發(fā)生明顯變化；細菌菌群中以桿菌屬為主，真菌菌群中以木霉屬為主，轉(zhuǎn)基因紅葉石楠對土壤微生物的多樣性無明顯影響。

關(guān)鍵詞：AmGS抗寒基因；紅葉石楠；土壤微生物

中圖分類號 S79 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）08-28-03

Abstract：An experiment was conducted to determine to dilution plate method for transfer AmGS cold-tolerant gene Photinia×fraseri microbial species and quantity of rhizosphere soil，and bacterial，fungal strains were cultured traits were analyzed，the results showed that：transfer AmGS gene Photinia×fraseri compared with the control group，no significant change bacterial species，fungi species and number did not change；The genera of Trichoderma were dominant in fungi communities and Bacillus in bacterial communities. The transgenic Photinia×fraseri had no evident effect on soil microbial diversity.

Key words：AmGS cold-tolerant gene；Photinia×fraseri；soil microbes

由于受地域及氣候影響，我國北方廣大地區(qū)栽植的樹種主要是落葉樹種，常綠樹種多為針葉樹，極少的常綠闊葉樹只能在山東省南部地區(qū)種植，北方大中城市（如北京、天津等）基本上沒有常綠闊葉喬木樹種，達不到四季常青的綠化效果，極大限制了城市園林綠化及苗木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展為解決觀賞園藝植物耐寒問題提供了有效的新途徑，利用抗寒基因轉(zhuǎn)化園林植物優(yōu)良品種，培育轉(zhuǎn)基因抗寒良種，將對豐富園林常綠闊葉樹，達到“三季有花、四季常綠”的效果，以及發(fā)展綠化苗木與花卉產(chǎn)業(yè)具有十分重要的意義。

紅葉石楠（Photinia×fraseri）是石楠屬的雜交種，為常綠小喬木或多枝叢生灌木，單葉輪生，葉披針形至長披針形，新梢及嫩葉鮮紅色，老葉革質(zhì)，葉表深綠具光澤，葉背綠色，光滑無毛。轉(zhuǎn)AmGS基因紅葉石楠是泰安市泰山林業(yè)科學研究院與中科院遺傳與發(fā)育研究所共同通過克隆木本植物沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶（AmGS）基因，利用根癌農(nóng)桿菌介導遺傳進行轉(zhuǎn)化，將AmGS基因?qū)爰t葉石楠中，經(jīng)多年試驗，該品系表現(xiàn)出較強的抗寒特性。為了能夠更快、更安全地進行示范推廣，筆者開展了轉(zhuǎn)AmGS抗寒基因紅葉石楠對土壤微生物多樣性的影響研究。

土壤微生物的多樣性是衡量生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要指標。微生物普遍存在于土壤、空氣、水中，對環(huán)境條件的變化反應非常敏感，它能夠較早地預測土壤養(yǎng)分及環(huán)境質(zhì)量的變化，是測定環(huán)境變化重要的生物指標之一。研究表明，轉(zhuǎn)基因植物的外源基因及其基因表達產(chǎn)物可通過植株的根系分泌物或殘茬進入土壤生態(tài)系統(tǒng)，或者通過基因水平轉(zhuǎn)移使得外源基因整合進土壤微生物的基因組中，可能使土壤微生物的遺傳和功能特性發(fā)生某種程度的改變，進而影響土壤微生物的多樣性。土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)中有其它生物無法代替的作用，隨著各種轉(zhuǎn)基因植物的不斷選育種植，這種變化對土壤微生物存在潛在危險，可能對生態(tài)系統(tǒng)造成影響。本文采用平板培養(yǎng)法研究了轉(zhuǎn)AmGS基因紅葉石楠對根際土壤微生物數(shù)量的影響，并研究了不同植株根際土壤細菌和真菌的培養(yǎng)性狀[1-2]。

1 材料與方法

1.1 供試材料 轉(zhuǎn)AmGS抗寒基因紅葉石楠，對照為“紅羅賓”紅葉石楠，均由泰山林業(yè)科學研究院提供。

1.2 試驗地點 泰山林科院肥城三環(huán)基地，面積約333.5m2。

1.3 土壤采樣 采用3點取樣法，在林地中選取轉(zhuǎn)基因植株和對照植株各3株，采集供試植株周邊根系土壤，采集時去除表層枯葉，用取樣器取0～10cm的土樣，轉(zhuǎn)入干凈的保鮮袋中，采集后5℃冷藏保存，然后對土壤微生物進行分析。

1.4 土壤微生物的分離、培養(yǎng)和鑒定 細菌、真菌的分離、培養(yǎng)和鑒定均參照孫海偉[3]的方法進行。實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件、Excel 2003進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中的微生物數(shù)量 利用平板菌落計數(shù)法對細菌菌落數(shù)量進行計數(shù)，詳見圖1。由圖1可知，轉(zhuǎn)基因植株根際土壤中細菌菌落數(shù)量1.09±0.106×108 CFU/g，非轉(zhuǎn)基因植株根際土壤中細菌菌落數(shù)量1.25±0.070 1×108 CFU/g，F(xiàn)=1.52，P>0.05，表明轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株根際土壤細菌菌落數(shù)量無顯著差異性。利用刮板接種法對真菌菌落的數(shù)量進行計數(shù)，詳見圖2。由圖2可知，轉(zhuǎn)基因植株根際土壤中真菌菌落數(shù)量1.37±0.293×104 CFU/g，非轉(zhuǎn)基因植株根際土壤中細菌菌落數(shù)量1.61±0.173×104 CFU/g，F(xiàn)=0.465，P>0.05，表明轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株根際土壤真菌落數(shù)量無顯著差異性。

2.2 土壤微生物的培養(yǎng)性狀

2.2.1 土壤中細菌菌株 對土壤細菌進一步分離、純化及培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征鑒定后，轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株根際土壤均分離得到8個細菌菌株，結(jié)果詳見表1。由表1可知，轉(zhuǎn)基因植株根際土壤細菌株系分別為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、黃單胞桿菌（Xanthomonas Campestris）、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis）、桿菌1（bacillus，未定名）、桿菌2、球菌1、球菌2、桿菌3，其中桿菌3未在非轉(zhuǎn)基因根際土壤中發(fā)現(xiàn)，其余菌株均分離得到；非轉(zhuǎn)基因植株根際土壤細菌株系分別為蠟樣芽胞桿菌、黃單胞桿菌、枯草芽孢桿菌、桿菌1、桿菌2、球菌1、球菌2、桿菌4，其中桿菌4未在轉(zhuǎn)基因植株根際土壤中發(fā)現(xiàn)，其余菌株均分離得到，表明轉(zhuǎn)AmGS抗寒基因紅葉石楠對土壤細菌的種類無明顯的影響。endprint

2.2.2 土壤中真菌菌株 通過對土壤中真菌的分離純化，根據(jù)培養(yǎng)形態(tài)及形態(tài)特征進行鑒定，結(jié)果詳見表2。由表2可知，轉(zhuǎn)基因根際土壤中真菌菌株為木霉屬（Triichoderma）、青霉屬（Penicillium），2種菌株均在非轉(zhuǎn)基因植株根際土壤中分離得到；非轉(zhuǎn)基因根際土壤中真菌菌株為曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬、青霉屬，其中曲霉屬未在轉(zhuǎn)基因植株的根際土壤中分離得到，表明轉(zhuǎn)AmGS抗寒基因紅葉石楠對土壤真菌的種類無明顯的影響。

3 結(jié)論與討論

本試驗研究了轉(zhuǎn)基因紅葉石楠對土壤微生物中細菌和真菌數(shù)量、種類的影響，綜上所述，轉(zhuǎn)基因紅葉石楠對土壤微生物中的細菌和真菌的多樣性無明顯的影響。

土壤微生物在生態(tài)環(huán)境中有著不可替代的作用，由于傳統(tǒng)生物技術(shù)和實驗條件的限制，人工可分離培養(yǎng)的土壤微生物只占到總量的1%～5%，大量的土壤微生物不能分離培養(yǎng)。近些年來，分子生物學技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在土壤微生物的分析中應用，克服了傳統(tǒng)生物技術(shù)的限制，更能全面有效地分析土壤微生物多樣性的特征。本研究中利用刮板接種法對真菌數(shù)量進行計數(shù)和利用平板菌落計數(shù)法對細菌進行計數(shù)，在實驗中存在諸多的局限和不足，不能全面的揭示轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物多樣性的影響，所以在土壤微生物群落多樣性的研究中，應結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)，但也不能忽視傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的作用。

本研究只是初步探討了菌群的數(shù)量和菌落的外觀性狀，僅對細菌和真菌的菌群進行了部分研究，對于轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物的影響還需要利用現(xiàn)代生物學技術(shù)進一步深入的研究。下一步應當對不同季節(jié)的土壤微生物群落變化及相同季節(jié)的土壤微生物群落穩(wěn)定性的差異，分析微生物生理生化特征，通過在分子水平上的研究，結(jié)合特定DNA序列分析、限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)等研究微生物群落的多樣性，繞過微生物菌種分離培養(yǎng)技術(shù)難關(guān)，直接在基因水平上研究。對于微生物多樣性，理應使用更多的技術(shù)從更多的方面來研究，從而更廣泛的、更完全的揭示土壤中微生物的種群結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化的特征，有效地揭示微生物多樣性對生態(tài)環(huán)境的影響[4-11]。

參考文獻

[1]周艷紅，丁襯襯，史建榮.轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物多樣性影響研究技術(shù)的進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010，04：362-365.

[2]高尚坤，劉靜，黃艷艷，等.轉(zhuǎn)TCS基因泡桐對土壤微生物的影響[J].東北林業(yè)大學學報，2012，04：41-45.

[3]孫海偉.沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶（AmGS）基因轉(zhuǎn)化類茶植物紅葉石楠的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學，2012.

[4]張昌朋.除草劑咪唑乙煙酸對土壤微生物多樣性影響及環(huán)境行為研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學院，2010.

[5]郭旺.轉(zhuǎn)基因大豆玉米小麥信息平臺建設及轉(zhuǎn)基因大豆對土壤微生物的影響研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學，2011.

[6]曹媛媛.不同環(huán)境下水稻土硫和重金屬形態(tài)轉(zhuǎn)化及微生物生態(tài)研究[D].浙江大學，2008.

[7]張鈴.轉(zhuǎn)SrMV-P_1基因甘蔗的環(huán)境安全性評價[D].福建農(nóng)林大學，2011.

[8]周海舟.應用PCR-DGGE技術(shù)研究錳污染農(nóng)田土壤微生物群落遺傳多樣性[D].湖南大學，2008.

[9]陳偉.蘋果園土壤微生物類群與栽培環(huán)境關(guān)系的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學，2007.

[10]姚曉華.土壤微生物群落多樣性研究方法及進展[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學，2008，S1：84-88.

[11]姚曉華.新殺蟲劑啶蟲脒對旱地土壤微生物生態(tài)影響及其降解研究[D].浙江大學，2005. （責編：張宏民）endprint

2.2.2 土壤中真菌菌株 通過對土壤中真菌的分離純化，根據(jù)培養(yǎng)形態(tài)及形態(tài)特征進行鑒定，結(jié)果詳見表2。由表2可知，轉(zhuǎn)基因根際土壤中真菌菌株為木霉屬（Triichoderma）、青霉屬（Penicillium），2種菌株均在非轉(zhuǎn)基因植株根際土壤中分離得到；非轉(zhuǎn)基因根際土壤中真菌菌株為曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬、青霉屬，其中曲霉屬未在轉(zhuǎn)基因植株的根際土壤中分離得到，表明轉(zhuǎn)AmGS抗寒基因紅葉石楠對土壤真菌的種類無明顯的影響。

3 結(jié)論與討論

本試驗研究了轉(zhuǎn)基因紅葉石楠對土壤微生物中細菌和真菌數(shù)量、種類的影響，綜上所述，轉(zhuǎn)基因紅葉石楠對土壤微生物中的細菌和真菌的多樣性無明顯的影響。

土壤微生物在生態(tài)環(huán)境中有著不可替代的作用，由于傳統(tǒng)生物技術(shù)和實驗條件的限制，人工可分離培養(yǎng)的土壤微生物只占到總量的1%～5%，大量的土壤微生物不能分離培養(yǎng)。近些年來，分子生物學技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在土壤微生物的分析中應用，克服了傳統(tǒng)生物技術(shù)的限制，更能全面有效地分析土壤微生物多樣性的特征。本研究中利用刮板接種法對真菌數(shù)量進行計數(shù)和利用平板菌落計數(shù)法對細菌進行計數(shù)，在實驗中存在諸多的局限和不足，不能全面的揭示轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物多樣性的影響，所以在土壤微生物群落多樣性的研究中，應結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)，但也不能忽視傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的作用。

本研究只是初步探討了菌群的數(shù)量和菌落的外觀性狀，僅對細菌和真菌的菌群進行了部分研究，對于轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物的影響還需要利用現(xiàn)代生物學技術(shù)進一步深入的研究。下一步應當對不同季節(jié)的土壤微生物群落變化及相同季節(jié)的土壤微生物群落穩(wěn)定性的差異，分析微生物生理生化特征，通過在分子水平上的研究，結(jié)合特定DNA序列分析、限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)等研究微生物群落的多樣性，繞過微生物菌種分離培養(yǎng)技術(shù)難關(guān)，直接在基因水平上研究。對于微生物多樣性，理應使用更多的技術(shù)從更多的方面來研究，從而更廣泛的、更完全的揭示土壤中微生物的種群結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化的特征，有效地揭示微生物多樣性對生態(tài)環(huán)境的影響[4-11]。

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[3]孫海偉.沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶（AmGS）基因轉(zhuǎn)化類茶植物紅葉石楠的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學，2012.

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[8]周海舟.應用PCR-DGGE技術(shù)研究錳污染農(nóng)田土壤微生物群落遺傳多樣性[D].湖南大學，2008.

[9]陳偉.蘋果園土壤微生物類群與栽培環(huán)境關(guān)系的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學，2007.

[10]姚曉華.土壤微生物群落多樣性研究方法及進展[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學，2008，S1：84-88.

[11]姚曉華.新殺蟲劑啶蟲脒對旱地土壤微生物生態(tài)影響及其降解研究[D].浙江大學，2005. （責編：張宏民）endprint

2.2.2 土壤中真菌菌株 通過對土壤中真菌的分離純化，根據(jù)培養(yǎng)形態(tài)及形態(tài)特征進行鑒定，結(jié)果詳見表2。由表2可知，轉(zhuǎn)基因根際土壤中真菌菌株為木霉屬（Triichoderma）、青霉屬（Penicillium），2種菌株均在非轉(zhuǎn)基因植株根際土壤中分離得到；非轉(zhuǎn)基因根際土壤中真菌菌株為曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬、青霉屬，其中曲霉屬未在轉(zhuǎn)基因植株的根際土壤中分離得到，表明轉(zhuǎn)AmGS抗寒基因紅葉石楠對土壤真菌的種類無明顯的影響。

3 結(jié)論與討論

本試驗研究了轉(zhuǎn)基因紅葉石楠對土壤微生物中細菌和真菌數(shù)量、種類的影響，綜上所述，轉(zhuǎn)基因紅葉石楠對土壤微生物中的細菌和真菌的多樣性無明顯的影響。

土壤微生物在生態(tài)環(huán)境中有著不可替代的作用，由于傳統(tǒng)生物技術(shù)和實驗條件的限制，人工可分離培養(yǎng)的土壤微生物只占到總量的1%～5%，大量的土壤微生物不能分離培養(yǎng)。近些年來，分子生物學技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在土壤微生物的分析中應用，克服了傳統(tǒng)生物技術(shù)的限制，更能全面有效地分析土壤微生物多樣性的特征。本研究中利用刮板接種法對真菌數(shù)量進行計數(shù)和利用平板菌落計數(shù)法對細菌進行計數(shù)，在實驗中存在諸多的局限和不足，不能全面的揭示轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物多樣性的影響，所以在土壤微生物群落多樣性的研究中，應結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)，但也不能忽視傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的作用。

本研究只是初步探討了菌群的數(shù)量和菌落的外觀性狀，僅對細菌和真菌的菌群進行了部分研究，對于轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物的影響還需要利用現(xiàn)代生物學技術(shù)進一步深入的研究。下一步應當對不同季節(jié)的土壤微生物群落變化及相同季節(jié)的土壤微生物群落穩(wěn)定性的差異，分析微生物生理生化特征，通過在分子水平上的研究，結(jié)合特定DNA序列分析、限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)等研究微生物群落的多樣性，繞過微生物菌種分離培養(yǎng)技術(shù)難關(guān)，直接在基因水平上研究。對于微生物多樣性，理應使用更多的技術(shù)從更多的方面來研究，從而更廣泛的、更完全的揭示土壤中微生物的種群結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化的特征，有效地揭示微生物多樣性對生態(tài)環(huán)境的影響[4-11]。

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[2]高尚坤，劉靜，黃艷艷，等.轉(zhuǎn)TCS基因泡桐對土壤微生物的影響[J].東北林業(yè)大學學報，2012，04：41-45.

[3]孫海偉.沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶（AmGS）基因轉(zhuǎn)化類茶植物紅葉石楠的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學，2012.

[4]張昌朋.除草劑咪唑乙煙酸對土壤微生物多樣性影響及環(huán)境行為研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學院，2010.

[5]郭旺.轉(zhuǎn)基因大豆玉米小麥信息平臺建設及轉(zhuǎn)基因大豆對土壤微生物的影響研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學，2011.

[6]曹媛媛.不同環(huán)境下水稻土硫和重金屬形態(tài)轉(zhuǎn)化及微生物生態(tài)研究[D].浙江大學，2008.

[7]張鈴.轉(zhuǎn)SrMV-P_1基因甘蔗的環(huán)境安全性評價[D].福建農(nóng)林大學，2011.

[8]周海舟.應用PCR-DGGE技術(shù)研究錳污染農(nóng)田土壤微生物群落遺傳多樣性[D].湖南大學，2008.

[9]陳偉.蘋果園土壤微生物類群與栽培環(huán)境關(guān)系的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學，2007.

[10]姚曉華.土壤微生物群落多樣性研究方法及進展[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學，2008，S1：84-88.

[11]姚曉華.新殺蟲劑啶蟲脒對旱地土壤微生物生態(tài)影響及其降解研究[D].浙江大學，2005. （責編：張宏民）endprint