笪寧虞

摘要：建立痔瘡膠囊微生物限度檢查法。關(guān)鍵詞：痔瘡膠囊；微生物限度檢查；方法驗(yàn)證【中圖分類號(hào)】R965【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1672-8602(2014)04-0120-01痔瘡膠囊具有清熱解毒，涼血止痛，祛風(fēng)消腫的功效。用于痔瘡，肛裂，大便秘結(jié)等癥。含有大黃等中藥成分。根據(jù)其制劑用藥途徑和制法，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、大腸埃希菌檢查。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，確定采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、大腸埃希菌檢查。經(jīng)對(duì)所確定的方法進(jìn)行驗(yàn)證，符合《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XIIIC有關(guān)微生物限度檢查法有關(guān)規(guī)定，方法可行。1實(shí)驗(yàn)儀器、試藥 1.1實(shí)驗(yàn)菌種:枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉。1.2樣品：痔瘡膠囊（批號(hào)：120301、120402、120603）；生產(chǎn)：廣西錦瑩藥業(yè)有限公司。1.3培養(yǎng)基及稀釋劑:營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，BL培養(yǎng)基等。1.4儀器:培養(yǎng)箱、生物安全柜等。2細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)檢驗(yàn)方法的建立及驗(yàn)證 2.1菌液制備:取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液,備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加10 ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。2.2供試液的制備方法: 常規(guī)法：取樣品10g，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1：10的供試液；取1：10的供試液1ml注皿。2.3回收率試驗(yàn):試驗(yàn)組：同2.2，另分別取各試驗(yàn)菌50～100CFU，分別注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h。菌液組：取試驗(yàn)菌50～100CFU注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h，測(cè)定所加入的試驗(yàn)菌數(shù)，平行制備2個(gè)平皿。供試品對(duì)照組：同2.2，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，霉菌和酵母菌培養(yǎng)48～72h，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。2.4方法的確定:選用金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為敏感菌株進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果見表1：表1敏感菌株常規(guī)法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 菌種 金黃色葡萄球菌（CFU/平皿） 白色念珠菌（CFU/平皿）計(jì)數(shù) 平皿 平均值平皿 平均值試驗(yàn)組 95 96 96 89 85 87供試品對(duì)照組 0 0 0 0 0 0菌液組 101 95 95 97 92 87 95 91回收率（%） 99 96結(jié)果：金黃色葡萄球菌回收率為99%，大于70%；白色念珠菌回收率為96%，大于70%，表明痔瘡膠囊對(duì)細(xì)菌、真菌無(wú)抑制作用，采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定可行。2.5細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證取3個(gè)批號(hào)痔瘡膠囊樣品，細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)按常規(guī)法進(jìn)行加菌回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表2、3、4：表2批號(hào)為120301的痔瘡膠囊回收率試驗(yàn)結(jié)果菌種回收率大腸埃希菌枯草芽孢桿菌 金黃的葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉計(jì)數(shù)平皿 平均值平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值試驗(yàn)組118 125 121 98 87 92 111 125 118 149 179 164 119 123 121供試品對(duì)照組0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0回收率（%）110 111 83 149 89表3批號(hào)為120402的痔瘡膠囊回收率試驗(yàn)結(jié)果 菌種回收率大腸埃希菌枯草芽孢桿菌 金黃的葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉計(jì)數(shù)平皿 平均值平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值試驗(yàn)組96 133 114 80 102 91 129 136 132 145 152 148 125 108 116供試品對(duì)照組0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0回收率（%）104 110 92 135 85表4批號(hào)為120603的痔瘡膠囊回收率試驗(yàn)結(jié)果 菌種回收率大腸埃希菌枯草芽孢桿菌 金黃的葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉計(jì)數(shù)平皿 平均值平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值試驗(yàn)組103 112 107 92 80 86 125 123 124 158 144 151 109 126 117供試品對(duì)照組0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0回收率（%）97 104 87 137 86三個(gè)批號(hào)樣品的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，以常規(guī)法進(jìn)行痔瘡膠囊細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)測(cè)定，五種規(guī)定試驗(yàn)菌的回收率均大于70%，符合《中國(guó)藥典》2010年版的規(guī)定，方法可行。3控制菌檢驗(yàn)方法的建立及驗(yàn)證 菌液制備同2.1。3.1大腸埃希菌： 常規(guī)法：試驗(yàn)組：取1：10供試液10ml接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，同時(shí)加入大腸埃希菌10～100CFU，35℃培養(yǎng)24～48h。取培養(yǎng)物0.2ml接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管中，35℃培養(yǎng)24h左右，366nm紫外燈下觀察熒光，然后進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)，觀察結(jié)果；另取培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)（EMB）平板，35℃培養(yǎng)18～24h，觀察其菌落形態(tài)。陰性菌對(duì)照組：取金黃色葡萄球菌作為陰性對(duì)照試驗(yàn)菌，方法同試驗(yàn)組。3.2試驗(yàn)結(jié)果： 大腸埃希菌：常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比較有明顯的變化，實(shí)驗(yàn)組有明顯產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，結(jié)果如表5: 表5大腸埃希菌檢查常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果大腸埃希菌 試驗(yàn)組 陰性菌對(duì)照組BL + -MUG，靛基質(zhì) +，+ -，-EMB平板 + -4結(jié)語(yǔ) 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬定痔瘡膠囊微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)正文如下：微生物限度取本品10g，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成1：10的供試液。細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、大腸埃希菌：取1：10的供試液，采用常規(guī)法，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。細(xì)菌數(shù)每1g不得過(guò)1000cfu，霉菌和酵母菌數(shù)每1g不得過(guò)100cfu，大腸埃希菌每1g不得檢出。5三批痔瘡膠囊的微生物限度檢查 按上述所建立的痔瘡膠囊微生物限度檢查法，對(duì)三批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見表6表6三批痔瘡膠囊微生物限度檢查結(jié)果批號(hào) 細(xì)菌數(shù) 霉菌、酵母菌數(shù) 大腸埃希菌 結(jié)論120301 小于10個(gè)/g 小于10個(gè)/g 未檢出 符合規(guī)定120402 小于10個(gè)/g 小于10個(gè)/g 未檢出 符合規(guī)定120603 小于10個(gè)/g 小于10個(gè)/g 未檢出 符合規(guī)定參考文獻(xiàn)[1]2010年版《中國(guó)藥典》一部(上接第119頁(yè))3討論 舒張性心力衰竭主要與心室充盈功能障礙等有關(guān)，由于左心室射血過(guò)程中承受壓力最大，造成心室充盈損傷更嚴(yán)重，加上患者伴有高血壓疾病，長(zhǎng)期高血壓控制不力，導(dǎo)致患者交感神經(jīng)異常興奮，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)功能紊亂，水鈉代謝異常，加重肺淤血癥狀[5]。相關(guān)研究表明舒張性心力衰竭與高血壓及年齡密切相關(guān)，對(duì)于老年高血壓伴發(fā)舒張性心力衰竭患者來(lái)說(shuō)，高血壓進(jìn)一步加重舒張功能損傷及心室充盈損傷，且血壓不間斷上升加重心臟負(fù)荷，可能演變?yōu)槌溲孕牧λソ?，最終威脅患者性命。相關(guān)研究及臨床實(shí)踐表明螺內(nèi)酯治療老年高血壓伴舒張性心力衰竭效果明顯，這與螺內(nèi)酯內(nèi)在機(jī)制有關(guān)，該藥物屬于一種特異性醛固酮拮抗劑，不僅可以利尿、保鉀及鎂元素，而且還可以增強(qiáng)心臟攝取去甲腎上腺素能力，維持心率平穩(wěn)，緩解患者心肌纖維變性及心律失常等癥狀，在心力衰竭、高血壓患者中得到廣泛的應(yīng)用。6分鐘步行測(cè)驗(yàn)作為臨床上一種操作簡(jiǎn)單的測(cè)定方法，主要是評(píng)價(jià)老年心力衰竭患者心臟功能及運(yùn)動(dòng)耐受力，本研究中實(shí)驗(yàn)組患者經(jīng)螺內(nèi)酯治療后6分鐘步行距離明顯長(zhǎng)與對(duì)照組，t值為4.755，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。可見螺內(nèi)酯可以更有效的改善患者心功能，提高患者運(yùn)動(dòng)耐受力。同時(shí)治療中用超聲心動(dòng)圖檢查患者左心室功能，由于心動(dòng)圖可以全面、連續(xù)、多方位的對(duì)患者心臟監(jiān)測(cè)，且能深入剖析心臟構(gòu)造，為此監(jiān)測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，為患者早期治療提供重要依據(jù)。實(shí)驗(yàn)組患者治療后超聲心動(dòng)圖觀測(cè)到E峰值、A峰值、E/A值明顯優(yōu)于對(duì)照組，可見螺內(nèi)酯可明顯改善患者心室舒張功能。另外，治療過(guò)程中對(duì)所有患者的血漿腦鈉肽及膠原氨基端肽等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，這是因?yàn)檠獫{腦鈉肽源自心室肌細(xì)胞，能有效擴(kuò)張血管，抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，效果與螺內(nèi)酯類似，可將其作為心力衰竭嚴(yán)重程度的判斷標(biāo)志。而膠原氨基端肽可以有效反映心肌纖維化程度。本研究中實(shí)驗(yàn)組患者治療后血漿腦鈉肽及膠原氨基端肽下降明顯優(yōu)于對(duì)照組，P＜0.05。綜上所述，螺內(nèi)酯能明顯改善高血壓合并舒張性心力衰竭老年患者心功能，提高其運(yùn)動(dòng)耐力，可深入研究利用。參考文獻(xiàn)[1]劉德惠.螺內(nèi)酯治療老年高血壓并發(fā)舒張性心力衰竭療效分析[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué),2013（06）:54-56. [2]朱志輝,孫維龍.螺內(nèi)酯治療老年高血壓并發(fā)舒張性心力衰竭的療效分析[J].北方藥學(xué),2013（09）:20-21. [3]劉海軍,籍振國(guó).螺內(nèi)酯對(duì)老年高血壓并發(fā)舒張性心力衰竭的療效觀察[J].疑難病雜志,2010（09）:674-675. [4]Borlaug BA，Lam CS，Roger VL，et al. Contractility and ventricular systolic stiffening in hypertensive heart disease insights into the pathogenesis of heart failure with preserved ejectionfraction [J]. J Am Coll Cardiol，2009（5）：410-418.[5]BadleM,RolgE,peerz-Villa F，et al.Incerased expression of the renin-angiotensin system and mast cell density but not of angiotensin-converting enzyme II in late satges of human heart failure [J].2006 (9):1117-1125.