于存等

摘要

[目的]明確白靈菇（Pleurotus ferulae）分泌木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase）的規(guī)律，以及白靈菇染料脫色的能力。[方法]利用紫外可見分光光度計，檢測4種培養(yǎng)方式下白靈菇木質(zhì)素降解酶活性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了白靈菇對5種染料的脫色研究。[結(jié)果] 4種培養(yǎng)方式下，可以檢測到MnP和Laccase的活性，但并未檢測到LiP。添加Mn2+和2，6二甲氧基苯酚（2，6DMP）對MnP和Laccase的產(chǎn)生有抑制作用，而添加青楊木屑可以將MnP的活性提高1.28倍，將Laccase的活性提高3.75倍；白靈菇對中性紅和活性黑2種染料的最大脫色率分別為87.12%和86.13%，對活性紅和剛果紅的最大脫色率分別為45.91%和32.28%，而對結(jié)晶紫幾乎無脫色能力。[結(jié)論] 白靈菇產(chǎn)Laccace活性要高于MnP；與脫色活性紅、剛果紅、結(jié)晶紫相比，白靈菇對中性紅和活性黑2種染料的脫色更為徹底。

關(guān)鍵詞白靈菇；錳過氧化物酶；漆酶；木質(zhì)素過氧化物酶；染料脫色

中圖分類號S646文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2014）06-01784-04

Abstract [Objective] The research aimed to understand the activities of Lignin Peroxidase， Manganese Peroxidase and Laccase of Pleurotus ferulae， and research the decolorization capacities on dyes by P. ferulae. [Method] By using UV/Vis spectrophotometer， the activities of ligninolytic enzymes of P. ferulae in four different culture conditions were detected. Furthermore， the decolorization capacities on five kinds of dyes by P. ferulae were studied. [Result] MnP and Laccase activity were detected without LiP in four different culture conditions. Adding Mn2+ and 2， 6DMP in the culture can inhibit the production of MnP and Laccase. By adding Populus ussuriensis wood chips， the capacity of MnP was improved by 1.28 times， and the capacity of Laccase was improved 3.75 times； that neutral red and reactive black were decolorized by P. ferulae effectively， the maximum decolorization ratio reached 87.12% and 86.13% respectively， and followed by reactive red and congo red， the maximum decolorization ratio was 45.91% and 32.28% respectively. In addition， there was hardly decolorization ability on crystal violet. [Conclusion] Producing of Laccase by P. ferulae is higher than MnP； decolorized of followed and reactive red more than thorough decolorized of neutral red and reactive black by P. ferulae.

Key words Pleurotus ferulae； Manganese Peroxidase； Laccase； Lignin Peroxidase； Dyes decolorization

白腐真菌 （whiterot fungi） 通過分泌木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）、錳過氧化物酶（Manganese peroxidase，MnP）和漆酶（Laccase）3種主要的木質(zhì)素降解酶系，可以有效降解有機(jī)氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、鹵素、合成染料等眾多難降解的污染物[1-6]。

全世界每年大約生產(chǎn)8×105 t染料，其中至少有10%的染料進(jìn)入到自然水體中[7]，這些染料不僅對自然界水體造成污染，還能直接或間接地對人體造成危害。目前，染料廢水主要的處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法，一般來說物理和化學(xué)方法對染料廢水的處理率較高，但是存在操作不便且可能產(chǎn)生二次污染的缺點(diǎn)。而與物理和化學(xué)法相比，生物法具有處理量大且不產(chǎn)生二次污染的優(yōu)點(diǎn)。白腐真菌作為微生物中的一大類群，由于可分泌漆酶 （Laccase）、過氧化物酶 （LiP） 和錳過氧化物酶（MnP）等多種胞外酶系及自身結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，其在染料脫色方面的重要作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)，近年來越來越多地受到人們的關(guān)注，成為生物法處理染料廢水研究中的熱點(diǎn)[8]。

白靈菇（Pleurotus ferulae Lanzi） 隸屬于真菌界擔(dān)子菌門傘菌綱傘菌目側(cè)耳科，是一種含有豐富多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素、食用纖維、多種礦物元素和微量元素的藥食兩用大型白腐真菌[9-10]。以往在其栽培、儲運(yùn)保鮮、分類、營養(yǎng)成分分析、多糖提取和食藥用價值等方面已有大量報道[11-18]，但是對白靈菇木質(zhì)素降解酶活性及其在染料脫色方面的研究，國內(nèi)外還未見詳細(xì)報道。筆者檢測了不同底物作用下白靈菇分泌木質(zhì)素降解酶的能力，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了白靈菇對5種染料的脫色研究，從而為今后深入研究白靈菇木質(zhì)素酶系統(tǒng)降解芳香族化合物的作用機(jī)制，及白靈菇在染料廢水脫色方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源。

白靈菇子實體采于黑龍江省伊春市東北林業(yè)大學(xué)涼水實驗林場，菌絲體保存于東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科森林病蟲病理實驗室4 ℃冰箱斜面培養(yǎng)基，試驗前截取斜面培養(yǎng)基的小塊菌絲接種于PDA平皿上，29 ℃活化10 d。

1.1.2培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯煮沸30 min后，添加20 g葡萄糖和15 g瓊脂粉，加水定容至1 L。PDB培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯煮沸30 min后，添加20 g葡萄糖，加水定容至1 L。

2結(jié)果與分析

2.1白靈菇4種培養(yǎng)方式下LiP活性的測定

4種不同培養(yǎng)方式下對白靈菇產(chǎn)LiP的酶活進(jìn)行檢測，結(jié)果在21 d內(nèi)均未檢測到吸光值的變化，表明白靈菇在4種培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生LiP。

2.2白靈菇4種培養(yǎng)方式下MnP活性的測定

4種培養(yǎng)方式下21 d內(nèi)白靈菇產(chǎn)MnP的結(jié)果見圖1。由圖1可知，4種培養(yǎng)方式下白靈菇均能產(chǎn)生MnP，且MnP活性呈先升高后

降低再升高的波動性變化。試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)方式A、B、D之間的產(chǎn)酶能力及酶活性隨時間的變化趨勢相似，都是在接入菌絲塊的第3天時就能檢測到MnP活性，且隨時間的推移酶活性逐漸增加，直至第7天時酶活性達(dá)到最大，A、B、D對應(yīng)的酶活性分別為13.28、10.47、9.07 U/L，之后酶活性均低于第7天，且呈現(xiàn)酶活性先降低再升高再降低的波動性變化。與A、B、D產(chǎn)酶不同，培養(yǎng)方式C在第9天時才出現(xiàn)一個酶活性高峰，酶活性為15.73 U/L，且酶活性在21 d內(nèi)的酶活性曲線除第7天低于培養(yǎng)方式A外，其他時刻均高于其他3種培養(yǎng)方式下的MnP活性；2.3白靈菇4種培養(yǎng)方式下Laccase活性的測定

由于在小分子介體物質(zhì)的存在下，Laccase可以氧化多種非酶底物的特性，其在食品和環(huán)保工業(yè)上的應(yīng)用研究日益活躍[21]。4種培養(yǎng)方式下白靈菇產(chǎn)Laccase隨時間變化結(jié)果見圖2。由圖2可知，4種培養(yǎng)方式下均能產(chǎn)生Laccase。培養(yǎng)方式A、B、D產(chǎn)酶能力接近，酶活性排序為A>D>B，表明添加Mn2+和2，6-DMP抑制了白靈菇產(chǎn)Laccase。培養(yǎng)方式C對應(yīng)的Laccase活性明顯高于A、B、D，表明添加青楊木屑可以顯著提高白靈菇產(chǎn)Laccase的能力。另外，觀察產(chǎn)Laccase隨時間的變化趨勢發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)方式A與C變化趨勢相似，在3 d時開始產(chǎn)生酶活性，并隨時間的推移逐漸增加，直至第9天后，酶活性出現(xiàn)波動性變化，至第17天酶活性有較大程度的提高且在19～21 d的酶活性維持在較高的水平，表明添加木屑并沒有改變白靈菇產(chǎn)Laccase的趨勢。A與C方式下最大酶活性分別出現(xiàn)在17 d和21 d，酶活性分別為39.67 U/L和 148.27 U/L，添加青楊木屑酶后Laccase活性提高了3.75倍；與A、C酶活變化趨勢不同，B與D產(chǎn)Laccase的變化趨勢相似，呈先升高分別在第5天和第7天達(dá)到酶活性最大值，酶活性分別為17.90 U/L和21.92 U/L，之后呈連續(xù)下降再升高的波動性變化。

是在3 d產(chǎn)生，然后迅速的升高，到7～9 d達(dá)到一個高峰值或者最大值，以后會迅速下降到一個較低值，然后緩慢地呈現(xiàn)升高之后下降再升高的波動趨勢。Laccase的變化曲線同樣在第3天產(chǎn)生，然后迅速升高，在7～9 d時達(dá)到一個峰值或最大值，之后呈現(xiàn)下降再升高的變化趨勢，在17～21 d出現(xiàn)一個峰值或最大值。這與迷宮栓孔菌 （Trametes gibbosa）產(chǎn)酶不同[5]，酶活曲線變化相對更為復(fù)雜一些。試驗結(jié)果表明，白靈菇產(chǎn)MnP和Laccase過程中Mn2+不是必需因子，在有無Mn2+的條件下均能產(chǎn)生酶活性，最大酶活量在加入Mn2+后有較小程度的下降。在培養(yǎng)過程中以木屑作為酶作用底物可以促進(jìn)MnP和Laccase的分泌。而添加2，6DMP作為白靈菇產(chǎn)酶的底物對MnP和Laccase的產(chǎn)生有一定的抑制作用。圖3為不同培養(yǎng)方式下MnP和Laccase在21 d內(nèi)最大酶活性的比較，由圖3可知，在各處理下Laccase酶活性都要高于MnP，分析這種差異，可能與氧化不同底物進(jìn)行酶活性測定的方法有關(guān)，也可能在降解芳香族化合物的過程中Laccase要發(fā)揮更大的作用，從而分泌量更大。

2.5白靈菇對5種染料的脫色

多數(shù)真菌既有吸附染料又有降解染料的功能[24]。在白靈菇木質(zhì)素降解酶系檢測的基礎(chǔ)上，為驗證其染料脫色的能力，進(jìn)行了白靈菇對3種不同結(jié)構(gòu)類型的5種染料脫色的研究。該項試驗首先以1 ml去離子水作為對照，在300～800 nm范圍內(nèi)對50 mg/L的5種染料進(jìn)行染料最大吸收波長的測定，測定結(jié)果為：活性黑 （λmax=595 nm），活性紅 （λmax=539 nm），剛果紅 （λmax=501 nm），結(jié)晶紫 （λmax=584 nm）和中性紅（λmax=528 nm）。白靈菇對5種染料11 d內(nèi)的脫色效果見圖4。由圖4可知，除結(jié)晶紫幾乎無脫色外，白靈菇對活性黑、活性紅、剛果紅、中性紅均能產(chǎn)生一定的脫色。脫色1 d后對活性黑脫色最為徹底，脫色率為60.79%，活性紅、剛果紅和中性紅依次減弱，脫色率分別為29.70%、20.09%、17.52%。1～5 d，除中性紅染料的脫色率顯著增加外，活性黑、活性紅、剛果紅染料的脫色率緩慢增加，且始終呈現(xiàn)脫色率活性黑>活性紅>剛果紅。5 d后幾種染料脫色率達(dá)到較高水平，上下波動不大，且呈現(xiàn)脫色率中性紅>活性黑>活性紅>剛果紅?；钚院?、活性紅、剛果紅、中性紅出現(xiàn)最大脫色率的時刻及脫色率分別為：活性黑 9 d，86.13%；活性紅7 d，45.91%；剛果紅5 d，32.28%；中性紅 9 d，87.12%。綜合以上結(jié)果，白靈菇對雜環(huán)類染料中性紅、偶氮類染料活性黑有較強(qiáng)的脫色能力，對偶氮類活性紅和剛果紅脫色能力次之，而對三苯甲烷類染料結(jié)晶紫無脫色能力。

3結(jié)論與討論

大多數(shù)白腐菌僅產(chǎn)生2種甚至1種分解木質(zhì)素的酶，如鮮紅密孔菌 （Pycnoporus cinnabarinus）只分泌Laccase，而不產(chǎn)生LiP和MnP，因此這3種酶在分解木質(zhì)素的過程中并不是全都必需的[23-24]。該研究通過檢測4種培養(yǎng)方式下白靈菇分泌LiP、MnP和Laccase的能力，發(fā)現(xiàn)白靈菇可以產(chǎn)生MnP和Laccase，但并不產(chǎn)生LiP。MnP和Laccase的活性受包含碳源種類、氮源種類、金屬離子、誘導(dǎo)劑等多項培養(yǎng)條件及環(huán)境因子的影響[25-26]。Mn2+是白腐菌產(chǎn)MnP的必要因子，添加2，6-DMP作為產(chǎn)酶底物可以促進(jìn)MnP和Laccase的分泌[20，24]。該研究在不添加Mn2+的培養(yǎng)方式下同樣能檢測到MnP的分泌，表明Mn2+不是白靈菇產(chǎn)MnP的必要因子。添加Mn2+和2，6-DMP對MnP和Laccase的產(chǎn)生有微弱抑制作用，而添加青楊木屑可以顯著提高2種酶的活性。

白腐菌除了通過分泌胞外酶的降解作用進(jìn)行染料脫色外，還通過菌體自身結(jié)構(gòu)與染料相契合的吸附作用進(jìn)行脫色，且由于不同種類染料的結(jié)構(gòu)各不相同，因此脫色效果也會存在顯著差異[1，27]。該研究中白靈菇可對中性紅和活性黑2種染料有效脫色，脫色率高達(dá)87.12%和86.13%，對活性紅和剛果紅脫色次之，脫色率僅為45.91%和32.28%，而對結(jié)晶紫幾乎不脫色。

參考文獻(xiàn)

[1]

SI J，PENG F，CUI B K.Purification，biochemical characterization and dye decolorization capacity of an alkali-resistant and metal-tolerant laccase from Trametes pubescens[J].Bioresource Technology， 2013，128（1）：49-57.

[2] 潘忠成，賴娜，李琛，等.白腐菌在廢水處理中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2013，42（7）：59-63.

[3] CAMERON M D，TIMOFEEVSKI S，AUST S D. Enzymology of Phanerochaete chrysosporium with respect to the degradation of recalcitrant Compounds and xenobiotics [J].Appl Microbiol Biotechnol，2000，54（6）：751-758.

[4] 袁海生，戴玉成，曹云，等.白腐真菌染料脫色菌株篩選及一色齒毛菌脫色條件的研究[J].菌物學(xué)報，2010，29（1）：429-436.

[5] 司靜，崔寶凱，戴玉成.東方栓孔菌在染料脫色中的應(yīng)用及其脫色條件的優(yōu)化[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2011，30（3）：364-371.

[6] 司靜，崔寶凱，戴玉成.栓孔菌屬漆酶高產(chǎn)菌株 的初步篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報，2011，38（3）：405-416.

[7] PALMIERI G，CENNAMO G，SANNIA G.Remazol Brilliant Blue R decolourisation by the fungus Pleurotus ostreatus and its oxidative enzymatic sys tem[J].Enzyme Microb Technol，2005，36（1）：17-27.

[8] 周韶紅.一株白腐真菌對剛果紅染料的脫色研究[J].蚌埠學(xué)院學(xué)報，2012（5）：8-12.

[9] 馬淑鳳，陳利梅，徐化能，等.白靈菇菌絲體多糖的分離純化及理化性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技，2009，12（30）：136-141.

[10] 林春，陳保生，李榮春.白靈菇研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2004，24（3）：46-49.

[11] 林杰.白靈菇栽培技術(shù)要點(diǎn)[J].中國食用菌，2000，19（5）：28-29.

[12] 馮麗琴，江常杰.白靈菇儲運(yùn)保鮮技術(shù)[J].農(nóng)村百事通，2007，13（1）：13-14.

[13] KIM B H，CHOI D，PIAO Y L，et al.Comparative study on the antioxidant and nitrite scavenging activity of fruiting body and mycelium extract

from Pleurotus ferulae[J].Korean Journal of Chemical Engineering，2012，29（10）：1393-1402.

[14] 胡順珍，徐梅，賈樂.白靈菇胞外多糖液體培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2007，28（7）：76-81.

[15] 王波，唐利民，熊鷹，等.白靈側(cè)耳（白靈菇）種質(zhì)資源評價[J].菌物系統(tǒng)，2003，22（3）：502-503.

[16] 常金芳，郁建鋒，冀宏.白靈菇rDNA-ITS序列多態(tài)性分析[J].常熟理工學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，26（8）：61-65.

[17] 戴玉成，楊祝良.中國藥用真菌名錄及部分名稱的修訂[J].菌物學(xué)報，2008，27（6）：801-824.

[18] 戴玉成，周麗偉，楊祝良，等.中國食用菌名錄[J].菌物學(xué)報，2010，29（1）：1-21.

[19] KIRK T K，SCHULTZ E，CONNORS W J，et al.Influence of culture parameters on lignin met abolism by phanerochaete chrysosorium[J].Archives of microbiology，1978，117（3）：277-285.

[20] 池玉杰，閆洪波.紅平菇木質(zhì)素過氧化物酶系統(tǒng)漆酶、錳過氧化物酶及木質(zhì)素過氧化物酶的檢測[J].林業(yè)科學(xué)，2009，45（12）：154-158.

[21] 勵建榮，李丹.漆酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（4）：262-264.

[22] SI J，CUI B K，DAI Y C.Decolorization of Chemically different dyes by whiterot fungi in submerged cultures[J].Annals of Microbiology，2013，63：1099- 1108.

[23] 王蓓，王圓，周曉云，等.錳過氧化物酶（MnP）的研究進(jìn)展[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2005，34（4）：28-34.

[24] 尹立偉.猴頭菇CB1錳過氧化物酶全長cDNA基因克隆及序列分析[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2010：2-5.

[25] 景致遠(yuǎn)，李呂木.錳過氧化物酶研究進(jìn)展[J].飼料博覽，2009（1）：11：8-11.

[26] 劉文華，蔡宇杰，范晶晶，等.毛栓軍產(chǎn)漆酶條件優(yōu)化及該酶對合成染料脫色的研究[J].微生物學(xué)通報，2013，40（5）：727-738.

[27] 趙麗艷，趙敏，盧磊，等.一色齒毛菌漆酶介體系統(tǒng)在染料脫色中的應(yīng)用[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，33（4）：130-135.