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摘要 綜述了20多年來轉基因豬的研究概況，探討了各種轉基因技術的特點，分析了胞質內單精子注射制備轉基因豬技術的特點和優(yōu)勢，并展望了單精子注射與人工染色體載體技術相結合制備大片段轉基因豬的應用前景。

關鍵詞 轉基因；單精注射；人工染色體；豬胚胎

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）08-02337-03

The Advantages and Prospect of Producing Transgenic Porcine by Intracytoplasmic Sperm Injection

HU Xiaorui， PAN Jianzhi et al

（Zhejiang Normal University， Jinhua， Zhejiang 321004； Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou， Zhejiang 310021）

Abstract The review was about the development of transgenic porcine in the last two decades. And the characteristics of different kinds of transgenic methods are discussed. This paper expounds the advantages of Intracytoplasmic Sperm Injection（ICSI） in producing transgenic porcine， and describes the application of producing large fragments of transgenic pigs by ICSI combined with artificial chromosome vectors technology.

Key words Transfer genes； ICSI； Artificial chromosome vectors； Pig embryo

豬的轉基因技術研究具有重要的理論和商業(yè)價值[1]。利用豬的轉基因技術能在較短時間內提高豬的生產(chǎn)性能和抗病能力，加快動物改良進程，培育出新的品種或種群；可用于研究未知基因的功能和關鍵基因的表達調控特點；也可作為生物反應器，還可為人異種器官移植提供供體等[2]。從技術角度來看，準備轉基因胚胎是制作轉基因豬的基礎，因為外源基因導入的載體或途徑不同，形成了各具特色和功效的轉基因技術[3]。其中，以精子為載體的方法統(tǒng)稱為精子介導轉基因技術（Spermmediated gene Transfer，SMGT），受精過程的控制對于精子能否將外源基因攜帶進入成熟卵子，進而整合至受精卵基因組，是決定制備轉基因胚胎成敗的關鍵。筆者對卵細胞胞質內單精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技術在豬轉基因中的應用進行了分析，以加深對這種轉基因方法的優(yōu)勢和應用前景的了解。

1 轉基因豬研究概況

豬既是重要的經(jīng)濟動物，也是人類醫(yī)學研究的一個重要模型動物，因為從自然特性來看，其在解剖、組織、生理和營養(yǎng)代謝等方面與人類略接近。因此，無論從農(nóng)業(yè)科技的角度還是人類醫(yī)療、基礎研究等方面，各國學者對轉基因豬的研究均極為重視。自1985年Hammer等得到第1批轉基因豬以來，有關轉基因豬的研究已有20多年的歷史。對豬生產(chǎn)性能的遺傳改良、作為生物反應器生產(chǎn)醫(yī)用蛋白以及作為異種器官移植的供體等方面都取得了一系列重要的進展。

在國外，Lo等[4]將小鼠抗磷酰膽堿（PC）抗體的α+κ鏈融合基因注入豬的受精卵，獲得的轉基因豬中產(chǎn)生的單克隆抗體已被證實具有抗病活性。Brem等將小鼠抗流感基因導入豬的基因組，得到的轉基因豬增強了對流感病毒的抵抗力。日本近畿大學入谷明教授等將菠菜 FAD12基因植入豬的受精卵中，成功培育出比普通豬不飽和脂肪酸含量高20%的轉基因豬。Lai等[5]將取自秀麗線蟲的FAT1基因導入豬的基因組，然后借助克隆技術培育出富含ω3脂肪酸的轉基因豬。美國弗吉尼亞大學Willam等[6]成功構建了在乳腺中特異表達人蛋白C的轉基因豬，其表達量是正常人血中含量的200倍。Paleyanda等將人凝血因子Ⅷ基因與乳腺表達載體相連接并導入豬，得到了在豬乳中表達人凝血因子Ⅷ的轉基因豬。Rosengard 等[7]將人DAF（促衰變因子）基因導入豬的基因組并得到表達，用這種轉基因豬的心臟移植給狒狒，成功克服了異種器官移植的超急性排斥反應。

在國內的研究始于20世紀80年代后期的國家“863”計劃，中國農(nóng)業(yè)大學陳永福教授與湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所魏慶信等人合作，1990年得到國內第1批轉OMTPGH基因豬[8]。2000年，魏慶信等[9]報道hDAF轉基因豬的制備獲得成功。我國湖北省農(nóng)業(yè)科學院鄭新民等成功構建轉人血清白蛋白基因豬，其血液中表達量高達 20 g/L 。賴良學博士[10]在美國密蘇里大學與其他研究人員應用豬胚胎成纖維細胞系進行基因打靶，獲得了敲除部分αGT（半乳糖苷轉移酶）基因的克隆豬。特別是近年來，包括筆者所在實驗室在內的一批研究機構成功構建多種轉基因豬或基因敲除豬。

2 豬轉基因常用方法的技術特點

目前，成功使用并獲得轉基因豬的方法主要有原核顯微注射法、核移植轉基因法、逆轉錄病毒載體法、精子載體法等。

2.1 原核顯微注射法

受精卵原核注射法是最早應用于家畜的轉基因方法[11]，最早建立的轉基因豬技術是參照小鼠的原核注射法，該技術就是使用精細的顯微注射針將外源基因直接注入豬受精卵的雄原核， 使外源基因整合到基因組， 從而獲得轉基因豬。用該方法制備轉基因豬的優(yōu)點是可以將較大片段的重組DNA注射到原核，獲得的轉基因動物能夠有效地表達，其缺點是成本較高，轉基因效率低，技術方面要求較高，注射的DNA整合到宿主基因組的效率低，得到轉基因子代往往是嵌合體，需要花費大量的費用和時間篩選轉基因個體，而且豬的受精卵含有大量的脂肪顆粒，在顯微鏡下較難看清原核。

2.2 體細胞核移植克隆法

體細胞核移植克隆法是目前轉基因技術應用最廣泛的方法，該技術是先將外源基因整合到供體細胞中，然后將供體細胞的細胞核移植到去核卵母細胞，組成重構胚胎，再將其移植到假孕母體，待其妊娠、分娩后即可得到轉基因的克隆豬。雖然該技術既能借助各種基因轉染手段制備轉基因個體，也能借助靶向基因敲除技術獲得基因敲除動物，但具有重組胚胎移植產(chǎn)仔率低、后代表型異常多發(fā)、制備成本高等缺點，篩選基因修飾細胞需要借助藥物基因標記，難以達到無選擇標記的基因轉化，利用電轉染或脂質體轉染大片段DNA時往往只有部分序列嵌合至基因組，因此也不適合大片段轉基因。

2.3 逆轉錄病毒法

逆轉錄病毒法的基本過程為：將目的基因重組到反轉錄病毒RNA 載體上，制成高滴度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可使胚胎與能釋放反轉錄病毒的單培養(yǎng)層細胞共孵育以達到感染的目的。反轉錄病毒RNA 進入寄主細胞后，被反轉錄為DNA，并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下整合到寄主細胞的基因組進行表達和遺傳，得到轉基因動物。逆轉錄病毒法雖然操作簡單，能有效將目的基因以單拷貝形式插入宿主，而且基因轉移的效率較高，但基因插入是隨機的，并且攜帶的DNA片段大小受限制，產(chǎn)生的后代大多為嵌合體，不容易建立ES細胞系。

2.4 精子載體法

精子載體法被認為是最簡便的轉基因方法。該方法只需將處理好的精子和外源DNA 共同孵育后，然后通過體外受精、人工授精轉染到胚胎中，從而得到轉基因豬個體。相關研究已有一些成功報道[12]，但其結果往往是外源基因只在PCR中被檢測到，推測外源基因已被分解為不完整的片斷。另外，從原理上分析，由于存在透明帶、細胞膜等自然屏障，卵子允許精子帶入不經(jīng)降解的外源DNA的可能性極低。精子載體法由于試驗結果難以重復，未能成為公認的可行途徑。此外，體外人工授精生產(chǎn)豬體外胚胎的技術系統(tǒng)還有待完善，其中主要因素之一是多精受精的高發(fā)，由此降低了體外胚胎的發(fā)育率和移植受胎率。

3 單精子注射轉基因法的特色優(yōu)勢

卵細胞胞質內單精子注射技術是20世紀80年代后期發(fā)展起來的一項新型人工輔助生殖技術，是借助顯微操作系統(tǒng)，將單一精子注入成熟卵母細胞胞質內使其受精的技術，能使任意單一精子不經(jīng)自然選擇而完成受精。由于ICSI繞過了正常受精的所有過程，避開了自然受精過程中卵丘顆粒細胞，透明質酸細胞外基質（放射冠）和穿透卵透明帶這三大屏障對精子的篩選作用，使ICSI具有受精率高和多精受精率低等優(yōu)點[13-15] 。迄今為止，該項技術已在兔、牛、小鼠、馬、猴、豬等動物和人類上獲得成功[16]。由于ICSI法具有受精率高和多精受精率低，其受精率不受精子濃度、形態(tài)和活力的影響，在受精機理的研究、野生動物遺傳資源保護、種質資源引進等領域具有廣泛的應用價值。

利用ICSI技術將攜帶外源基因DNA的精子導入卵母細胞，是單精子注射法轉基因（ICSISMGT）的基本原理。ICSISMGT法廣義上也可稱為精子載體法的一種，但其受精通過人為的精子注射完成，避開了自然受精的保護屏障，因而具有傳統(tǒng)的精子載體轉基因方法所無法比擬的優(yōu)勢。①對外源基因片段的長度限制少，不僅可以導入小片段DNA（<5 kb）而且還可以導入大片段DNA（11.9～170 kb）甚至細菌或人造染色體（BAC或MAC）[13-14，17-19]，適用范圍與受精卵原核注射法相似，但顯微注射法的難度低、效率更高；②單精子受精的精子不需要具有外部結構的完整性和運動能力，可通過各種理化處理促進與外源基因DNA的結合，提高基因導入效率；③精子和DNA的復合體直接輸入卵細胞，不需要體外受精的孵育過程，排除了透明帶和卵質膜對精子入卵的阻礙作用，外源基因受損的幾率大大降低，有利于導入基因保持完整性；④基本排除多精入卵的可能性，受精率和胚胎正常發(fā)育率高，大大節(jié)約準備成熟豬卵母細胞核精子所付出的時間和成本。

將精子載體轉基因法（SMGT）與單精注射（ICSI）結合制備轉基因動物是一種新的轉基因技術，研究歷史較短，但其可行性和高效性已在多個物種中得到證實。1999年ICSI技術被首次應用于小鼠轉基因[20]。2004年日本KOTO等[21]成功獲得ICSI轉基因大鼠。作為一種新型的動物轉基因技術，利用ICSI生產(chǎn)轉基因動物在國際上獲得了巨大成功，不僅可以獲得整合小片段外源DNA的小鼠和大鼠，而且還可以生產(chǎn)分子量高達250 kb的細菌人工染色體（BAC）等人工染色體的轉基因小鼠。2011年LIU等[22]將ICSI技術應用于青鳉魚的轉基因并獲得了成功。

豬的ICSI研究起步較晚。Hosoi等[23]最早將豬活精子注入豬卵母細胞的包漿內觀察到原核形成。Kim等[24]分別將豬的精子和精子頭注入體內成熟卵母細胞內獲得囊胚。2000年，Koo等[25]將精子與外源基因共孵育后通過ICSI注入豬體外成熟卵母細胞中獲得轉基因嵌合囊胚。Martin[26]采用體內成熟卵母細胞經(jīng)ICSI首次獲得存活的小豬。2003年，Michiko等[27]報道了體外成熟培養(yǎng)卵母細胞經(jīng)ICSI獲得3頭健康小豬。2006年Kurome等[28]將精子與攜帶有人白蛋白（hALB）和綠色熒光蛋白（GFP）基因序列的DNA片段共孵育，用ICSI技術生產(chǎn)出1頭表達hALB和GFP的轉基因仔豬。2007年又通過對精子-外源基因DNA復合體制備方法進行改進，使ICSI法轉基因胚胎的囊胚發(fā)育率、外源基因EGFP的表達陽性率大幅度提高，7頭胚胎移植產(chǎn)仔中轉基因個體有2頭[29]。由此可見，ICSI顯微技術與精子載體技術相結合為生產(chǎn)轉基因動物開辟了一條簡單易行的技術路線。

4 ICSI介導豬轉基因技術的應用與展望

盡管家豬轉基因技術已取得了較大進步，多種轉基因豬表現(xiàn)出良好的產(chǎn)業(yè)化應用前景，但豬的轉基因育種等應用研究還存在著諸多制約因素。例如，對家畜基因組的結構、功能和表達調控機制的研究尚不夠深入，可選擇利用的功效基因資源缺乏；轉基因家畜生產(chǎn)效率低、成本高、周期長、通過大規(guī)模的轉基因動物來篩選優(yōu)良家系的花費巨大；外源基因的體內表達很難控制，容易偏離正常調控而喪失功能，或擾亂動物機體的生理平衡；對單個基因進行遺傳操作，難以獲得由多基因控制的數(shù)量性狀的改良；人們對轉基因動物的生物安全存在疑慮。這些問題的解決首先需要依靠功能基因組學基礎研究的深入，更需要轉基因技術本身的進步和成熟。

大片段轉基因在轉基因技術研發(fā)和轉基因育種應用研究中具有重要的意義。只有能夠導入大片段外源基因，才有可能改變目前轉基因主要是cDNA而非基因組中自然序列的現(xiàn)狀，也有希望通過附加更多基因上游或下游序列，實現(xiàn)轉基因表達的精細、有效調控。因此，高效率導入大片段DNA的轉基因是近年來轉基因技術研究的一個重要方向。人工染色體（Artificial chromosome）介導的轉基因是大片段轉基因的典型例子，其為動物轉基因技術展現(xiàn)了一個新的平臺。

人工染色體是指人工構建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)，包括酵母人工染色體（YAC）、細菌人工染色體（BAC）、P1派生人工染色體（PAC）和哺乳動物人工染色體（MAC）等，通常用于基因組圖譜制作、基因分離以及基因組序列分析的工具。以細菌人工染色體（BACs）為例，BAC載體可以在1個單一克隆中包含完整的基因座位，包括編碼區(qū)、內含子和調控區(qū)，而且具有克隆DNA能穩(wěn)定復制、易分離、操作簡單的特點。

以BAC作為轉基因載體，由于BAC攜帶的基因包括上下游調控序列，可以與轉錄酶、轉錄因子等作用，轉基因將能遵守基因固有的表達機制[30-31]。另外，導入的外源序列在受體基因組中營造一種相對獨立的環(huán)境，消除或減少染色體位置效應的影響，可以最大程度地保持基因本身的表達時空調控特征。因此，利用BAC轉基因已經(jīng)成為小鼠上對候選基因直接進行功能研究的有力手段。同時，在動物生物反應器研制中，利用BAC轉基因較采用短片段的組織特異性啟動子更容易實現(xiàn)外源基因在特定部位的高水平表達。1999年Stinnakre等[32]將克隆有山羊α乳清蛋白及其兩側非編碼區(qū)的BAC DNA片段顯微注射到小鼠受精卵原核，獲得了高濃度乳腺特異表達的轉基因小鼠。此外，目前的BAC載體可以通過α互補原理替換內含基因的蛋白編碼序列，用來表達其他目的基因。依靠載體骨架兩端的稀少型限制酶切位點（例如NotⅠ），可以將基因表達單元的長片段克隆DNA回收用于轉基因，因而能夠避免載體中附帶的藥物篩選基因等序列進入動物基因組。

小鼠BAC轉染主要利用受精卵原核注射方法，而豬受精卵內分布大量脂滴，造成原核可視性極差，難以采用原核注射法進行轉基因操作，使大片段DNA的基因轉導缺乏有效技術手段，而ICSI介導的轉基因有望解決豬轉基因的難題。2012年日本明治大學長嶋教授研究組[33]利用ICSI方法進行豬BAC轉基因研究獲得成功，開創(chuàng)了國際上豬ICSIBAC轉基因的先例。ICSI技術與BAC轉基因技術相結合制備轉基因豬，為今后制備大片段轉基因豬提供了新方法，相信該技術必定會受到越來越多的關注，并被廣泛研究與應用，成為今后轉基因豬研究的優(yōu)選技術途徑。

42卷8期 胡驍睿等 胞質內單精子注射制備轉基因豬技術的優(yōu)勢與前景

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