馮曉東，陳國(guó)梁，喬 璟，常海飛

(1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院;2.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000)

棗樹分布于我國(guó)北方廣大地區(qū)，一般生長(zhǎng)在中溫帶與寒帶過(guò)渡帶，棗樹也是近年來(lái)黃河中下游流域退耕還林和發(fā)展經(jīng)濟(jì)林果的主要樹種之一。隨著棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和市場(chǎng)需求的變化，對(duì)棗樹品種及其品質(zhì)特性提出了更多、更高的要求，從而對(duì)棗品質(zhì)育種研究提出了新的目標(biāo)。利用基因工程方法建立一個(gè)完整、穩(wěn)定的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，不僅可為外源基因的導(dǎo)入奠定技術(shù)基礎(chǔ)，還可推動(dòng)品種的定向改良，縮短育種周期，創(chuàng)造出新的優(yōu)良品種［1］。

植物基因工程育種的前提是建立一種簡(jiǎn)便、快速、有效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，以便把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，進(jìn)而從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)［2，3］是當(dāng)前棗樹新品種培育研究中不可缺少的技術(shù)，可將轉(zhuǎn)基因特性傳遞給后代而無(wú)需多代選育，因此具有較大的優(yōu)勢(shì)。雖然對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究已經(jīng)進(jìn)行多次改進(jìn)，但仍存在一些問(wèn)題，本試驗(yàn)以駿棗的愈傷組織為外植體，篩選適合駿棗愈傷組織誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基，對(duì)其再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了初步研究，為建立一種穩(wěn)妥可靠的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化方法提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

取健壯的繼代培養(yǎng)14 d駿棗(Zizyphus jujubeMill JunZao)無(wú)菌愈傷組織，由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院紅棗繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 工程農(nóng)桿菌

工程農(nóng)桿菌菌株(根癌農(nóng)桿菌LBA4404，攜帶pART－GF1－2植物表達(dá)載體)，該工程農(nóng)桿菌LBA4404－GF含gbss基因5＇側(cè)翼序列及其驅(qū)動(dòng)的正反向目的片段，其結(jié)構(gòu)如圖1所示:

圖1 GBSS基因5＇側(cè)翼序列驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)干擾載體的構(gòu)建模式圖

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)

將同一生長(zhǎng)狀態(tài)下的無(wú)菌愈傷組織接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行避光培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MS+6－BA0.4 mg/L+2，4－D1.2 mg/L。選取預(yù)培養(yǎng)6天，繼代14天的愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.2.2 工程農(nóng)桿菌的菌懸液制備

從平板上挑取工程農(nóng)桿菌 LBA4404(含有pART－GF1－2)單菌落，接種于YEP液體培養(yǎng)基中(含 100 mg/LKan、50 mg/LStr)，于恒溫 28℃搖床上260 rpm振蕩暗培養(yǎng)24～36 h活化。然后將活化好的菌液按1∶50進(jìn)行放大培養(yǎng)，培養(yǎng)6～8 h，待工程菌生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌活性最大時(shí)，倒入無(wú)菌離心管中，5000r/min離心5min，收集的菌體用MS液體培養(yǎng)基稀釋至 OD600分別為0.2、0.4、0.6、0.8 待用。

1.2.3 卡那霉素選擇壓的確定

將預(yù)培養(yǎng)后的駿棗無(wú)菌愈傷組織分別接種到含Kan 濃度為 0、25、50、75、100、125 mg/L 的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每處理各水平外植體25個(gè)，每次處理重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度28℃，光周期12/d，光強(qiáng)1500～2000 lx，20 d后統(tǒng)計(jì)駿棗新愈傷組織的產(chǎn)生率。

1.2.4 愈傷組織的浸染

切取一定數(shù)量的、生長(zhǎng)健壯駿棗無(wú)菌愈傷組織，切成0.5 cm左右的小塊，置于工程農(nóng)桿菌菌液(菌液 OD600值分別為 0.2、0.4、0.6、0.8)中浸染，浸染時(shí)間依次為5、10、15 min，取出轉(zhuǎn)化材料，用滅菌濾紙拭去其表面菌液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，于28℃暗處共培養(yǎng)。

1.2.5 浸染外植體的脫菌與篩選

將共培養(yǎng)后外植體轉(zhuǎn)入含250 mg/L頭孢霉素，125 mg/L卡那霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并在脫菌與抗性篩選的過(guò)程中誘導(dǎo)愈傷組織的形成。

1.2.6 CTAB 法提取駿棗愈傷組織 DNA［4－6］

選取抗Kan的愈傷組織0.5 g，用CTAB法提取DNA。

1.2.7 愈傷組織的PCR檢測(cè)［7－8］

以轉(zhuǎn)化的駿棗愈傷組織DNA為模板，以pART－GF1－2LBA4404菌液作為陽(yáng)性對(duì)照，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的駿棗愈傷組織DNA為陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為800 bp，凝膠電泳瓊脂糖濃度選擇1.2%。

PCR擴(kuò)增條件如下:預(yù)變性(94℃，5 min);變性(94℃，50 s)，退火(50℃，45 s)，延伸(72℃，50 s)，循環(huán)30次;最后延伸(72℃，10 min)，4℃保存。

1.2.8 駿棗遺傳轉(zhuǎn)化率的初步統(tǒng)計(jì)

進(jìn)行9個(gè)批次的遺傳轉(zhuǎn)化，每個(gè)批次均浸染數(shù)十個(gè)駿棗外植體，統(tǒng)計(jì)浸染、共培養(yǎng)、脫菌與抗性篩選過(guò)程中外植體的損失，最后通過(guò)CTAB法提取DNA，并由PCR檢測(cè)鑒定目的基因?qū)腧E棗外植體的結(jié)果，計(jì)算遺傳轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Kan對(duì)駿棗愈傷組織再生的影響

從表2中可以看出當(dāng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不含Kan時(shí)，愈傷組織再生頻率可達(dá)90.5%;含Kan 25～75 mg/L時(shí)，愈傷組織再生受到抑制;含125 mg/L以上時(shí)，幾乎完全抑制了愈傷組織的再生;更大濃度時(shí)，愈傷組織再生率均為零，而且愈傷組織均迅速褐化死亡，以125mg/LKan作為駿棗愈傷組織的篩選濃度。

2.2 預(yù)培養(yǎng)對(duì)愈傷組織再生的影響

由表3可以看出，預(yù)培養(yǎng)6 d后浸染的駿棗愈傷組織再生頻率高于其他處理，表明駿棗愈傷組織預(yù)培養(yǎng)后浸染要好于未經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的，且預(yù)培養(yǎng)6 d后進(jìn)行浸染較利于遺傳轉(zhuǎn)化。

表1 Kan對(duì)駿棗愈傷組織再生的影響

表2 受體材料預(yù)培養(yǎng)對(duì)愈傷組織再生的影響

2.3 農(nóng)桿菌液濃度及浸染時(shí)間對(duì)共培養(yǎng)的影響

從表可以看出看，雖然菌液濃度及浸染時(shí)間對(duì)共培養(yǎng)的影響不是很大，但以O(shè)D600為0.4～0.6的濃度在浸染10 min的條件下比較適宜。

表3 農(nóng)桿菌菌液濃度與浸染時(shí)間對(duì)共培養(yǎng)的影響

2.4 駿棗愈傷組織DNA的PCR鑒定結(jié)果

圖2 以gl－1/gl－6為引物的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)

圖2顯示，浸染過(guò)的駿棗愈傷組織1和2出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，且與工程菌質(zhì)粒的擴(kuò)增條帶在同一個(gè)水平上，表明工程菌的目的基因已經(jīng)整合至駿棗愈傷組織的DNA中。

2.5 駿棗遺傳轉(zhuǎn)化率的初步統(tǒng)計(jì)結(jié)果

從表5統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，經(jīng)PCR檢測(cè)到目的基因的愈傷組織僅出現(xiàn)在9個(gè)批次的3個(gè)批次中。試驗(yàn)中共浸染396個(gè)愈傷組織，產(chǎn)生了12個(gè)卡那霉素抗性愈傷組織，通過(guò)對(duì)抗性個(gè)體的PCR檢測(cè)驗(yàn)證，只有3個(gè)將外源基因轉(zhuǎn)移到了植物的基因組中，其最終轉(zhuǎn)化率僅為0.75%。

表4 駿棗遺傳轉(zhuǎn)化率的初步統(tǒng)計(jì)

3 小結(jié)與討論

建立高效的組織培養(yǎng)和再生體系是高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)用駿棗愈傷組織作外植體，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，研究了轉(zhuǎn)化過(guò)程中影響轉(zhuǎn)化的各種因素，得到了適合駿棗愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的適合條件，初步實(shí)現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的駿棗愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化。

3.1 駿棗愈傷組織對(duì)Kan選擇壓的確定

不同植株對(duì)同一種類的抗生素敏感程度不同［9－10］，同一種植株的不同器官對(duì)同一種類的抗生素敏感程度也不同。試驗(yàn)結(jié)果表明駿棗愈傷組織誘導(dǎo)的新愈傷組織對(duì)卡那霉素敏感，合適篩選濃度為125 mg/L。

3.2 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

預(yù)培養(yǎng)的目的一方面是使外植體盡快適應(yīng)新的生長(zhǎng)條件，促進(jìn)細(xì)胞分裂，而分裂狀態(tài)的細(xì)胞更容易整合外源DNA，因而可以提高轉(zhuǎn)化效率;另一方面是能減少褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生［11］。棗樹為木本植物是含酚類物質(zhì)較多的一類植物，因此采用預(yù)培養(yǎng)這一步驟則顯得尤為重要。試驗(yàn)表明預(yù)培養(yǎng)6 d后進(jìn)行浸染較利于遺傳轉(zhuǎn)化。

3.3 浸染濃度和侵染時(shí)間對(duì)共培養(yǎng)的影響

在浸染過(guò)程中，菌液濃度和浸染時(shí)間是兩個(gè)主要參數(shù)。浸染濃度與時(shí)間值過(guò)小則因外植體上附著的菌體較少而降低農(nóng)桿菌的浸入，浸染濃度與時(shí)間值過(guò)大則會(huì)對(duì)外植體造成傷害，且在后續(xù)培養(yǎng)中很難抑制農(nóng)桿菌而引起污染。當(dāng)根癌農(nóng)桿菌濃度在一定范圍內(nèi)，濃度高時(shí)適當(dāng)縮短浸染時(shí)間，濃度低時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)浸染時(shí)間均可以得到較高的轉(zhuǎn)化率［12］。試驗(yàn)表明菌液濃度和浸染時(shí)間對(duì)共培養(yǎng)影響不大，但以O(shè)D600為0.4～0.6的濃度在浸染10 min的條件下比較適宜。試驗(yàn)表明，對(duì)于駿棗愈傷組織，共培養(yǎng)16d處理后的愈傷組織誘導(dǎo)效果較好。

最后，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)PCR檢測(cè)，在9個(gè)批次中得到了2個(gè)批次的轉(zhuǎn)基因植株，初步證明外源目的基因已整合到駿棗基因組中。但遺傳轉(zhuǎn)化率較低，最終轉(zhuǎn)化率僅為0.75%。至于建立完善的駿棗遺傳轉(zhuǎn)化體系及各參數(shù)的量化分析有待進(jìn)一步的研究。

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