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        產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌10768原生質(zhì)體紫外誘變探討

        2014-05-30 05:13:54鐘麗娟趙新海池景良張慶華朱巍巍關(guān)艷麗
        浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年5期
        關(guān)鍵詞:剛果紅原生質(zhì)致死率

        鐘麗娟,趙新海,池景良,張慶華,朱巍巍,關(guān)艷麗

        (遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧 朝陽 122000)

        利用原生質(zhì)體進(jìn)行微生物遺傳育種是近幾十年來迅速發(fā)展的一種育種技術(shù),其基本實驗方法已較成熟,主要集中在原生質(zhì)體制備及再生、紫外及化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合與轉(zhuǎn)化等方面。應(yīng)用原生質(zhì)體誘變技術(shù)改造微生物菌種在實踐中取得了顯著成果,例如通過原生質(zhì)體紫外誘變提高相關(guān)菌種產(chǎn)紫杉醇、蘇云金毒素、谷胱甘肽、α-淀粉酶等微生物代謝產(chǎn)物的能力[1]。作者對秸稈生物降解產(chǎn)品的生產(chǎn)菌株10768進(jìn)行原生質(zhì)體紫外誘變,比較了突變菌株的剛果紅透明圈大小和纖維素酶活力,旨在篩選出高產(chǎn)纖維素酶的菌株,為下一步菌種選育及菌株改良提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 供試菌株

        LCCC10768由遼寧省微生物菌種保藏中心提供,該菌株為遼寧省微生物科學(xué)研究院自主研發(fā)的秸稈生物降解菌種,產(chǎn)品已獲得農(nóng)業(yè)部微生物肥臨時登記證 (2011臨字1374號)。

        1.2 原生質(zhì)體制備

        取進(jìn)入對數(shù)生長期的菌種以1%的接種量轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中,30℃,180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 h后,加入4 U·mL-1青霉素鈉溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h,3000 r·min-1離心10min收集菌體,用高滲磷酸緩沖液洗滌2次,調(diào)整菌體濃度至108個·mL-1,吸取菌液 10mL,3000 r·min-1離心5min,加入5mL溶菌酶緩慢混合均勻,置于37℃溫水浴中保溫酶解,每隔30min取樣鏡檢,至大部分菌體破壁,釋放出原生質(zhì)體即停止酶解。酶解結(jié)束后,3000 r·min-1離心10min,用高滲磷酸緩沖液洗滌2次以清除酶液,將原生質(zhì)體重新懸浮于滲透壓穩(wěn)定液SMM中[2],用血球計數(shù)板計數(shù),計算原生質(zhì)體形成率[3-6]。

        1.3 原生質(zhì)體紫外誘變

        將制備好的原生質(zhì)體用SMM稀釋至106mL-1,取5mL于無菌培養(yǎng)皿中,將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上,調(diào)整距離為30 cm,紫外燈照射劑量分別為30 s,60 s和120 s,照射的同時進(jìn)行磁力攪拌[7]。

        1.4 原生質(zhì)體再生

        在暗室條件下,將經(jīng)過紫外誘變的原生質(zhì)體分別用SMM和無菌水進(jìn)行梯度稀釋,輕輕吸放于DM3琥珀酸鈉再生培養(yǎng)基[8]上 (下層加入2%瓊脂,上層加入0.5%瓊脂,提前一天倒好再生培養(yǎng)基的下層,以使表面干燥),緩慢倒入培養(yǎng)基上層,混合均勻,每處理重復(fù)3次,放置于紙箱中避光,30℃恒溫培養(yǎng)。將未進(jìn)行紫外誘變的原生質(zhì)體用SMM稀釋后吸放于再生培養(yǎng)基上培養(yǎng),3次重復(fù),用于計算紫外致死率。

        其中,A為未誘變的原生質(zhì)體再生菌落數(shù),B為SMM稀釋的紫外誘變原生質(zhì)體菌落數(shù)。

        其中,B為SMM稀釋后再生菌落數(shù),C為水稀釋后生長菌落數(shù),D為血球計數(shù)器法測得的原生質(zhì)體數(shù)。

        將經(jīng)過紫外照射60 s,將DM3培養(yǎng)基上生長出的菌落挑至LB平板培養(yǎng)基上,劃線純化保存。

        1.5 剛果紅透明圈法初篩

        將突變菌株點(diǎn)接至CMC-Na培養(yǎng)基上,30℃恒溫培養(yǎng)48 h,用游標(biāo)卡尺測定菌落直徑后,倒入10mg·mL-1剛果紅染色1 h后,用1 mol·L-1NaCl溶液沖洗,測定透明圈直徑。

        1.6 突變菌株液體產(chǎn)酶活力測定

        將供試液體菌株以2%接種至秸稈粉培養(yǎng)基中,30℃,180 r·min-1振蕩培養(yǎng)120 h后,將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)于7000 r·min-14℃條件下離心10min,上清液即為粗酶液。產(chǎn)酶活力測定方法參照吳紅艷等[9]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 紫外誘變劑量對菌株10768原生質(zhì)體致死率的影響

        不同紫外誘變劑量對10768原生質(zhì)體致死率的影響見表1,隨著誘變劑量增加,致死率升高,據(jù)文獻(xiàn)報道,致死率在70%~80%時存活菌變異現(xiàn)象顯著,正突變率高,誘變效果好。因此選擇10768原生質(zhì)體的紫外誘變劑量為60 s。

        表1 紫外誘變劑量對原生質(zhì)體致死率及再生率的影響

        2.2 突變菌株剛果紅透明圈法初篩結(jié)果

        利用紫外突變,共分離出97株菌株,分別點(diǎn)接至CMC-Na培養(yǎng)基上,其中11株透明圈較大,其透明圈直徑/菌落直徑均大于原始菌株,測定結(jié)果見表2。UV09,UV14和UV22的比值較大,選擇這3個菌株為優(yōu)良突變株進(jìn)行纖維素酶酶活的測定。

        表2 原生質(zhì)體再生突變株剛果紅透明圈法測定結(jié)果

        2.3 突變菌株液體培養(yǎng)物纖維素酶活測定結(jié)果

        供試的3株突變菌株的纖維素酶活力測定結(jié)果見表3。透明圈大的突變株,其在液體培養(yǎng)基中纖維素酶活也高,其中UV22的纖維素酶活較原始菌株提高了51%。

        表3 突變菌株固體培養(yǎng)物纖維素酶活測定結(jié)果

        3 小結(jié)與討論

        本文主要研究了秸稈生物降解菌株10768的原生質(zhì)體紫外誘變劑量及其突變株纖維素酶活力。雖然原生質(zhì)體制備的試驗技術(shù)已相當(dāng)成熟,但不同菌株生理特性各異,原生質(zhì)體制備條件不盡相同,本研究在原生質(zhì)體制備中加入了4 U·mL-1青霉素,縮短了試驗周期;所獲得的97株突變株有3株透明圈直徑/菌落直徑的比值大于4.38,纖維素酶活力較原始菌株提高30%以上,尤其是UV22的纖維素酶活力增加了50.90%。本試驗結(jié)果表明原生質(zhì)體紫外誘變技術(shù)是進(jìn)行菌種選育的有效手段,后續(xù)還將開展突變菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性的研究。隨著原生質(zhì)體技術(shù)的發(fā)展,微生物的原生質(zhì)體融合及轉(zhuǎn)化技術(shù)也已日漸成熟[10],融合2株乃至多株菌株從而獲得多個優(yōu)良性狀的生產(chǎn)菌種是微生物菌種選育今后的努力方向。

        [1]丁曉兵,李宗偉,劉曉波,等.原生質(zhì)體誘變在工業(yè)微生物育種中的應(yīng)用進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2008(7):260-262.

        [2]張克旭,陳寧,張永志,等.用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育谷氨酸高產(chǎn)菌[J].微生物學(xué)報,1991,31(2):108-114.

        [3]袁鑄,王忠彥,胡承,等.地衣芽孢桿菌JF-20菌原生質(zhì)體的形成及其再生的最佳條件[J].四川大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2001,38(5):723-727.

        [4]涂永勤,肖崇剛.蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus cereus)原生質(zhì)體形成與再生條件研究 [J].生物學(xué)雜志,2005,22(5):17-19.

        [5]王媛媛,段玉璽,陳立杰,等.枯草芽孢桿菌 Snb2原生質(zhì)體制備和再生研究 [J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,42(1):110-113.

        [6]鄭重誼,譚周進(jìn),肖克宇,等.不同因素對兩株細(xì)菌原生質(zhì)體制備的影響[J].生物技術(shù)通報,2007(5):131-135.

        [7]謝鳳行,張峰峰,周可,等.原生質(zhì)體誘變選育高纖維素酶活性枯草芽孢桿菌的研究 [J].華北農(nóng)學(xué)報,2010,25(5):211-214.

        [8]劉新梅,高宇,趙靜,等.納豆菌原生質(zhì)體制備與再生條件的研究 [J].食品科學(xué),2007,28(5):231-236.

        [9]吳紅艷,王智學(xué),陳飛,等.有機(jī)物料腐熟劑中纖維素酶活力測定方法的驗證 [J].微生物學(xué)雜志,2011,31(4):107-109.

        [10]王登宇,臧威,孫劍秋,等.細(xì)菌原生質(zhì)體融合育種技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展[J].中國釀造,2008,184(7):1-6.

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