陶華娟 蔡坤 修霞 路興軍 王磊

（山東省濰坊市婦幼保健院 遺傳科，山東 濰坊 261011）

隨著醫(yī)療水平和人民生活水平的提高，孕產(chǎn)婦及新生兒死亡率都有了明顯的降低。然而，自然流產(chǎn)率在臨床確診妊娠中為10%～15%[1]，仍然居高不下。導(dǎo)致自然流產(chǎn)的病因復(fù)雜，包括遺傳因素和環(huán)境因素，其中遺傳因素主要包括流產(chǎn)夫婦和流產(chǎn)胚胎的染色體異常。本研究通過(guò)對(duì)染色體正常夫婦的流產(chǎn)胚胎進(jìn)行染色體分析，以探討自然流產(chǎn)的發(fā)生與胚胎染色體異常的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2012年8月至2013年9月在濰坊市婦幼保健院婦科或計(jì)生科行流產(chǎn)術(shù)的患者136例，年齡21～40歲，平均29.5歲，妊娠周數(shù)5～26周，平均孕8＋6周；同時(shí)要求滿足以下條件：①排除雙親染色體異常；②B超提示胚胎停止發(fā)育；③排除母體疾病所導(dǎo)致的流產(chǎn)。136例流產(chǎn)組織中（雙胎3例），包括132例絨毛組織，4例死胎肌肉組織。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 流產(chǎn)組織的采集 無(wú)菌條件下，用生理鹽水清洗流產(chǎn)絨毛組織，去除母血及母體蛻膜組織，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的絨毛組織用于細(xì)胞培養(yǎng)和FISH檢測(cè)。

1.2.2 流產(chǎn)組織染色體標(biāo)本制備 用手術(shù)刀片將絨毛組織切碎，消化后在37℃，5%CO2濃度下靜置培養(yǎng)。收獲、制片、G顯帶各步驟均按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行；每例標(biāo)本常規(guī)計(jì)數(shù)分析20個(gè)中期分裂象，并用染色體核型分析軟件分析5個(gè)核型。培養(yǎng)超過(guò)1個(gè)月細(xì)胞仍不生長(zhǎng)時(shí)，視為培養(yǎng)失敗[2]。

1.2.3 流產(chǎn)組織的FISH檢測(cè) 取剪碎的流產(chǎn)組織經(jīng)洗滌、制備玻片、預(yù)處理及變性雜交、雜交后洗滌等步驟處理后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并用熒光圖像處理系統(tǒng)（美國(guó)PSI公司）進(jìn)行熒光圖像采集和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，χ2檢驗(yàn)P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 136例自然流產(chǎn)組織標(biāo)本中，染色體正常70例，異常66例，異常率為48.53%。FISH檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 熒光顯微鏡下FISH的檢測(cè)結(jié)果（核為DAPI染色×1 000倍）

圖A為47，XX，＋13所用13/21探針組，綠色信號(hào)代表13號(hào)染色體，紅色信號(hào)代表21號(hào)染色體；圖B為47，XY，＋16所用16/22探針組，紅色信號(hào)代表16號(hào)染色體，綠色信號(hào)代表22號(hào)染色體；圖C為47，XY，＋22所用16/22探針組，紅色信號(hào)代表16號(hào)染色體，綠色信號(hào)代表22號(hào)染色體；圖D為45，X所用18/X/Y探針組，天藍(lán)色信號(hào)代表18號(hào)染色體，綠色信號(hào)代表X染色體。

2.2 136例自然流產(chǎn)組織98例細(xì)胞培養(yǎng)成功，38例培養(yǎng)失敗，培養(yǎng)失敗率為27.94%，136例經(jīng)FISH全部檢測(cè)成功，比較98例FISH與核型分析結(jié)果，一致率為97.96%，見(jiàn)表1。

2.3 136例自然流產(chǎn)組織根據(jù)孕婦的年齡分組，染色體異常率不同，但兩兩間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.4 136例自然流產(chǎn)組織根據(jù)孕婦的自然流產(chǎn)情況分組，其中流產(chǎn)1次者80例，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者56例，其染色體異常率分別為48.75%和48.21%，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

3 討 論

隨著醫(yī)學(xué)科技的不斷發(fā)展，如產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷技術(shù)的應(yīng)用，避免了染色體異?；純旱某錾?，使我國(guó)婦女兒童健康有了很大的提高，但對(duì)于自然流產(chǎn)患者，目前尚無(wú)明確的檢查指標(biāo)和有效的治療措施。染色體異常是自然流產(chǎn)最常見(jiàn)的原因，包括胚胎染色體異常和流產(chǎn)夫婦的染色體異常，其中前者是導(dǎo)致自然流產(chǎn)發(fā)生的主要原因。在本研究中，F(xiàn)ISH聯(lián)合G顯帶檢測(cè)出流產(chǎn)組織染色體異常率為48.53%，可見(jiàn)染色體異常是導(dǎo)致流產(chǎn)的重要因素之一。早期報(bào)道顯示50%～70%自然流產(chǎn)與染色體異常有關(guān)，胚胎染色體數(shù)目異常的主要原因在于配子發(fā)生的減數(shù)分裂中或受精卵的早期卵裂過(guò)程出現(xiàn)了染色體復(fù)制和行為異常。

表1 66例染色體異常病例的異常類型及異常率

表2 孕婦不同年齡組染色體異常率

表3 不同流產(chǎn)次數(shù)染色體異常率

自然流產(chǎn)組織存在的主要染色體異常類型是三體型、三倍體和單體型，有細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明，導(dǎo)致自然流產(chǎn)發(fā)生的主要是染色體的數(shù)目異常（86%），其次有染色體的結(jié)構(gòu)異常（6%）和嵌合體（8%），在我們的98例細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)病例中，染色體數(shù)目異常44例（91.67%），染色體結(jié)構(gòu)異常2例（4.17%），嵌合體2例（4.17%），與以往研究基本一致，主要表現(xiàn)為染色體的數(shù)目異常。流產(chǎn)胚胎的染色體異常大都是新發(fā)的染色體異常，表明其異常的發(fā)生主要是由于配子形成和胚胎發(fā)育早期隨機(jī)發(fā)生[3]。以往報(bào)道表明三體的發(fā)生與母體高齡有很大關(guān)系，40歲以上的孕婦因其產(chǎn)生的卵子質(zhì)量下降因此流產(chǎn)率更高，但是否會(huì)導(dǎo)致胚胎染色體異常尚未見(jiàn)報(bào)道[4]，隨著目前社會(huì)結(jié)婚年齡和育齡的推遲，胚胎三體型的發(fā)生率可能有所增加。在本研究中，不同年齡組孕婦的流產(chǎn)胚胎染色體異常率不同，但兩兩間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與部分年齡組的病例數(shù)過(guò)少有關(guān)，對(duì)于流產(chǎn)胚胎的染色體異常率與孕婦年齡的相關(guān)性，我們將進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指連續(xù)或不連續(xù)流產(chǎn)發(fā)生2次及2次以上者[5]。不同流產(chǎn)史孕婦其流產(chǎn)胚胎組織的染色體異常發(fā)生率不同，有文獻(xiàn)報(bào)道第一次流產(chǎn)染色體異常率更高，隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，染色體異常的頻率呈下降趨勢(shì)[10，11]，如 Merel[6]等通過(guò)對(duì)1359例自然流產(chǎn)標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)胚胎組織染色體異常率為39%，低于初次流產(chǎn)胚胎組織的染色體異常率45%。但我們的研究比較初次流產(chǎn)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)其胚胎的染色體異常率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)主要與父母雙方染色體異常有關(guān)，主要包括隨機(jī)聯(lián)合和染色體異態(tài)，本研究排除雙親染色體異常，因此對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組織染色體異常率的檢測(cè)結(jié)果可能與其他研究有所不同。既往研究表明[7]，5%的夫婦受到復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的影響，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦染色體平衡易位發(fā)生率為2%～5%，高于普通人群，但對(duì)于其染色體的總體異常發(fā)生率目前尚無(wú)一致結(jié)論。

一般認(rèn)為早期流產(chǎn)胚胎50%存在染色體異常，也有報(bào)道認(rèn)為染色體異常實(shí)際發(fā)生率可能明顯高于這個(gè)比例，只是常規(guī)染色體核型分析的檢出率低[8]。在該研究中，對(duì)于自然流產(chǎn)組織的檢測(cè)，我們不僅選用了核型分析的方法，而且采用了FISH檢測(cè)技術(shù)，F(xiàn)ISH檢測(cè)不僅具有檢測(cè)快速的特點(diǎn)，而且可以不通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)直接檢測(cè)間期核。自然流產(chǎn)組織經(jīng)陰道排出，存在污染的可能性，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的失敗率增加，以往報(bào)道，在檢測(cè)流產(chǎn)組織時(shí)存在5%～42%的培養(yǎng)失敗率[9，10]。FISH因其檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛用于產(chǎn)前診斷，快速出具檢測(cè)結(jié)果有利于減輕孕婦及家屬的精神負(fù)擔(dān)，并為臨床醫(yī)生進(jìn)行早期處理提供寶貴時(shí)間，減輕晚期引產(chǎn)對(duì)孕婦身體的傷害。

因此，目前發(fā)展的分子遺傳學(xué)可彌補(bǔ)傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)后核型分析的一些缺點(diǎn)，分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)主要包括全基因組診斷（chromosomal-CGH和array-CGH）染色體特定部位基因診斷技術(shù)（FISH，MLPA和QF-PCR），主要用于細(xì)胞培養(yǎng)失敗染色體的檢測(cè)。Shearer[11]等收集流產(chǎn)組織5555例，其中培養(yǎng)失敗762例，對(duì)這762例標(biāo)本進(jìn)行FISH檢測(cè)，727例檢測(cè)成功，成功率為95%，檢出異常181例，異常率為25%。同時(shí)，也有研究應(yīng)用FISH技術(shù)的Y染色體特異性探針，用于母體細(xì)胞污染的鑒定。然而，這些分子遺傳學(xué)檢測(cè)方法因種種原因還不能完全取代核型分析技術(shù)，如成本高、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、無(wú)法檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)異常、檢測(cè)的基因變異臨床價(jià)值不確定等缺點(diǎn)，因此目前仍無(wú)法取代核型分析。

有研究表明，自然流產(chǎn)組織除了核型分析可發(fā)現(xiàn)的染色體異常外，通過(guò)aCGH發(fā)現(xiàn)有5%存在核型分析不能發(fā)現(xiàn)的基因拷貝數(shù)的變異，但對(duì)于這些拷貝數(shù)變異的臨床價(jià)值還不能確定，截至目前僅有一項(xiàng)研究[12]，同時(shí)檢測(cè)了雙親與流產(chǎn)胚胎的基因拷貝數(shù)變異，通過(guò)比較基因拷貝數(shù)變異是新發(fā)還是遺傳于雙親而判斷基因拷貝數(shù)變異的臨床價(jià)值。

總之，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，多種技術(shù)已被廣泛用于染色體疾病的產(chǎn)前診斷，使產(chǎn)前診斷的水平不斷提高，診斷結(jié)果快速準(zhǔn)確。產(chǎn)前診斷有利于胎兒的早期診斷，以決定胎兒取舍，避免患兒出生，達(dá)到優(yōu)生的目的；同時(shí)對(duì)于曾孕有染色體異?；純旱姆驄D，再次生育受累患兒的風(fēng)險(xiǎn)率增加，因此此類家庭在計(jì)劃妊娠或再次懷孕時(shí)，有必要接受遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。

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