李琪琳，褚瑜光，胡元會，劉瑞華，王映紅，苗朝霞

代謝組學是研究生物體受病理生理刺激或基因改變而引起的體內代謝物動態(tài)變化的一門科學，其研究的技術和方法日趨成熟，在病變標志物的發(fā)現、疾病的診斷和治療、藥物藥效及毒理安全性評價等方面得到了廣泛的應用［1－3］。ACEI類藥物被公認為治療心力衰竭的重要藥物，卡托普利作為ACEI的代表，已被證實其可以有效抑制RAAS，限制心室重構，降低心衰患者的發(fā)病率和死亡率［4］。本研究采用1H－NMR 技術研究卡托普利對心梗后心衰大鼠尿液代謝組學的影響，進一步探討卡托普利治療心衰的機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 正常雄性SD 大鼠20只（體重200g～250g），購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（京）2012－0001），分籠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院SPF 級動物房。

1.2 實驗藥物 卡托普利（批號：20100329）。

1.3 實驗儀器 Bruker AVANCE Ⅲ－600 MHz超導傅立葉變化核磁共振波譜儀（Bruker Corporation，Switzerland），主要配置：場強為11.75T（500MHz）的超導磁體，1H／13C／31P／19F四核探頭、梯度反相探頭（109Ag－31P）、固體高分辨魔角旋轉探頭（15N－31P）；HX－200 動 物 呼 吸 機（成 都 泰 盟 科 技 有 限 公 司）；Value plus 系 列 超 低 溫 冰 箱（Thermo Revco，USA）；Cenirifuge5415D 臺式低溫1－15pk超速離心機（Eppendorf－MiniSpin／plus，German）。

1.4 動物模型復制 參照Pfeffer［5］報道的方法復制心衰動物模型。

1.5 實驗分組 動物購回后喂養(yǎng)標準合成飼料，適應性喂養(yǎng)3 d，禁食12h后造模。術后24h對模型大鼠行超聲心動圖檢測，以射血分數（EF）減損＞15%為入選標準。將入選模型大鼠隨機分為模型組、卡托普利組，每組大鼠不少于6只。

1.6 實驗給藥 模型組生理鹽水4.0ml／kg灌胃，每天一次；卡托普利組100mg／kg溶于生理鹽水中灌胃。各組連續(xù)給藥8周。

1.7 尿液采集及處理 各組大鼠灌胃8周后，以代謝籠收集大鼠24h尿液，經4℃，12 000r／min離心15min，取上層尿液，于－80℃冰箱中保存。室溫解凍后取20μL上清，添加D2O：H2O 為1∶9和0.05%TSP的混合液40μL，最后將制備好的尿液樣品加入1.7 mm 核磁樣品管中，使用Bruker AVANCE Ⅲ－600 MHz超導傅立葉變化核磁共振波譜儀進行測量。

1.8 數據采集和處理 分別采用弛豫時間編輯（Carr－Purcell－Meiboom－Gill，CPMG）和 擴 散 編 輯（longitudinal eddy－delay，LED）脈沖序列檢測尿液中小分子及大分子代謝物。在超導傅立葉變換NMR 儀上調用NOE 相關2D－NMR 譜（nuclear overhauser effect spectroscopy，NOESY）脈沖序列，設置參數。實驗參數：譜寬8 000Hz，預飽和時間為2s，采樣點數32k，累加次數128次，預飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。自由感應衰減（free induction decay，FID）信號經過填零為32k點后，再加上0.5Hz的線增寬因子，經傅立葉變換轉為1H－NMR 圖譜。以TSP的化學位移參考峰的位置，設為0。調用AMIX（Analysis of MIXtures software v.3.0，Bruker Biospin）軟件中的程序將0.5～6ppm 范圍內的圖譜按照每段0.04ppm 進行分段積分。將積分按每張譜的總積分強度歸一化。然后以Excel文件貯存，用于模式識別分析。

1.9 統計學處理 數據輸入到SIMCA－P12.0軟件中進行主成分分析（PCA），為了鑒別區(qū)分各組間對代謝輪廓貢獻較大的代謝物，將數據進行正交信號校正處理，然后進行偏最小二乘法－判別分析，即O－PLS－DA。結果以得分圖和載荷圖體現。

2 結 果

2.1 卡托普利組與模型組代謝圖譜分析 由PCA 得分圖看出，兩組小分子（圖1）及大分子（圖2）代謝圖譜均能明顯區(qū)分，小分子圖譜解釋度R2Y＝0.926，大分子圖譜解釋度R2Y＝0.891，說明PCA 模型對樣本解釋度較高。采用OPLS－DA 對兩組間差異代謝物進行分析得出，與模型組相比，卡托普利組谷氨酰胺、肌肝、?；撬帷幟仕?、蘋果酸、苯基丙氨酸含量升高；3－羥基丁酸、乙酸、丙酮、磷脂酰膽堿、三甲胺、馬尿酸含量下降。結果提示卡托普利能有效調節(jié)心衰大鼠尿液代謝紊亂，并促使代謝表型向正常范圍回歸。

圖1 卡托普利組與模型組大鼠尿液低場區(qū)代謝物變化模式識別得分圖及載荷圖

圖2 卡托普利組與模型組大鼠尿液高場區(qū)代謝物變化模式識別得分圖及載荷圖

2.2 卡托普利組與模型組差異代謝物變化 采用OPLS－DA對組間差異代謝物進行分析，結合主成分載荷圖，確定以下物質（見表1）對分類貢獻較大。

表1 差異代謝物變化表

3 討 論

作為各種心臟病的終末段，心力衰竭的高患病率、高死亡率儼然已使其成為人類共同面對的一個公共健康問題。心力衰竭的一個基本病理機制為心室重塑，因此，對于心力衰竭進行有效治療，關鍵在于對神經內分泌系統的過渡激活狀況予以阻斷，避免出現心室重塑。ACEI是目前公認治療心衰的基石之一，作為一個比較常用的ACEI制劑，卡托普利不但可以抑制血管緊張素轉換酶，使AngⅡ生成減少，擴張外周血管，減輕心臟前后負荷，還可以抑制緩激肽的降解，激活磷脂酶A，增加前列腺素水平，抑制RAAS，使β受體密度上調，防治左室重構；同時，還能抑制交感神經活性，糾正心衰患者的電解質紊亂，使血鉀、血鈉、血鎂維持正常，從而降低心律失常及猝死的發(fā)生率［6］。但是，卡托普利治療心衰是否存在其他作用機制，代謝組學技術的發(fā)展，為從代謝的角度揭示心衰病理生理學過程的動態(tài)變化以及它們所包含的生物學意義提供了新的工具和方法，也為探索ACEI制劑治療心衰的作用機制提供了新的靶點和思路。

本實驗利用1H－NMR代謝組學技術，通過對心衰大鼠代謝物圖譜進行多元統計分析和模式識別處理，觀察了卡托普利對心衰大鼠尿液代謝的影響。從實驗結果看，根據PCA 得分圖，模型組與卡托普利組兩組小分子及大分子代謝圖譜能明顯區(qū)分，提示卡托普利能調節(jié)心衰大鼠代謝紊亂，并促使代謝表型向正常范圍回歸。

卡托普利組與模型組對比：與能量代謝相關的檸檬酸、蘋果酸含量升高；與糖、脂代謝有關的化合物有3－羥基丁酸、丙酮、乙酸、磷脂酰膽堿等濃度降低，與氨基酸代謝有關的化合物有谷氨酰胺、苯基丙氨酸、牛磺酸濃度升高?？梢?，心梗后心衰大鼠尿液代謝組學出現比較明顯的糖、脂、氨基酸、能量代謝紊亂，卡托普利可以有效調節(jié)心衰大鼠尿液代謝紊亂，這可能是其治療心衰的作用機制之一，但其具體的作用途徑有待進一步研究。

［1］ Oresic M，Viadal PA，Hanninen V.Metabolomic approaches to phenotype characterization and applications to complex diseases［J］.Expert Rev Mol Diagn，2006，6（4）：575－585.

［2］ Mally A，Ambers A，Hard GC，et al.Are 4－h(huán)ydroxy－2（E）－nonenal derived mercapturic acids and H－1 NMR metabonomics potential biomarkers of chemically induced oxidative stress in the kidney［J］.Toxicology，2007，230（23）：244－255.

［3］ Bowser R，Cudkowicz M，Kaddurah DR.Biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis［J］.Expert Rev Mol Diagn，2006，6（3）：387－398.

［4］ 黃峻.心力衰竭治療的基石：血管緊張素轉換酶抑制劑［J］.中華心血管病雜志，2002，30（4）：255－257.

［5］ Pfeffer MA，Braunwald E.Ventricular remodelling after myocardial infarction：Experimental observations and clinical implications［J］.Circulation，1990，81：1161－1172.

［6］ 伍尚強.卡托普利對心力衰竭患者的臨床療效觀察［J］.中國醫(yī)療前沿，2009，4（24）：12－13.