李 麗，劉 晶，蔣繼志

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000）

Survivin基因融合蛋白的表達(dá)與純化

李 麗，劉 晶，蔣繼志

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000）

目的 Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)中最強(qiáng)的凋亡抑制因子，純化得到其功能結(jié)構(gòu)域(BIR)的融合蛋白可為進(jìn)一步研究Survivin基因與相關(guān)基因的相互作用提供依據(jù)。方法 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增Survivin基因中的BIR序列后連接到pGEX4T-2載體上，經(jīng)大腸桿菌(DH5α)驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌菌株并用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，以谷胱甘肽瓊脂糖親和層析技術(shù)純化融合蛋白。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增得到的BIR片段約為276 bp，純化得到的融合蛋白分子質(zhì)量大小約為37 ku。結(jié)論 PCR結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致，構(gòu)建重組體后經(jīng)IPTG在22℃下誘導(dǎo)2 h，菌體中融合蛋白的表達(dá)量顯著增加，為下一步研究Survivin基因的功能和與其相互作用的蛋白奠定了基礎(chǔ)。

Survivin; pGEX4T-2；IPTG誘導(dǎo)；純化

Ambrosin等1997年應(yīng)用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1（effector cell protease receptor-1）首次從人類(lèi)基因組cDNA中分離獲得的凋亡抑制基因Survivin(生存素)[1-2]，它是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中最強(qiáng)的凋亡抑制因子。IAP家族一般含有2～3個(gè)串聯(lián)的含有半胱氨酸/組氨酸共有序列在內(nèi)的70個(gè)氨基酸組成的桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)系列(baculovirus IAP repeat, BIR)分子以及羧基末端環(huán)指結(jié)構(gòu)，其中的BIR分子發(fā)揮抗凋亡作用[3-4]。而Survivin結(jié)構(gòu)特殊，氨基酸N端僅含有一個(gè)單一的為細(xì)胞凋亡抑制所必需的較為保守的BIR功能區(qū)，羧基端不含有環(huán)指結(jié)構(gòu)，代以交織螺旋結(jié)構(gòu)(coiledcoil)，其34位上的蘇氨酸磷酸化，對(duì)維持蛋白的穩(wěn)定性以及協(xié)同細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制蛋白即CDK1(Cyclin-depended kinases inhibitors, CDKIs)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期正確過(guò)度起重要作用[5-8]。因此，對(duì)Survivin蛋白N端的BIR結(jié)構(gòu)域的研究已有一些報(bào)道[9-10]，但對(duì)BIR結(jié)構(gòu)域與IAP家族其它成員之間在抗凋亡過(guò)程中的協(xié)同作用報(bào)道還很少[11-15]。本實(shí)驗(yàn)擬利用PCR擴(kuò)增得到Survivin基因的BIR結(jié)構(gòu)域，與原核表達(dá)載體pGEX4T-2重組并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株得到重組體的融合蛋白，為進(jìn)一步探討Survivin基因的BIR結(jié)構(gòu)域與IAP家族其它成員（例如XIAP）之間的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

Survivin基因由廈門(mén)大學(xué)惠贈(zèng)，DNA Marker蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)(Protein Molecular Weight Marker) (low)，均購(gòu)自Takara 公司，質(zhì)粒小提試劑盒（TIANprep Mini Plasmid Kit）和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit）購(gòu)于天根生化科技有限公司（北京）；大腸埃希菌E.coli DH5α和E.coli.BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的DNA序列(NCBI)利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，其上游引物和下游引物分別附加了不同的酶切位點(diǎn)，以便插入載體。上游引物5'CGggatccGGTGCCCCGACGTT3'下游引物5'AAActcgagTCAATCCATGGCAG3'

1.3 重組體的構(gòu)建

將Survivin基因進(jìn)行PCR，并將其擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，將回收的產(chǎn)物和pGEX4T-2 (GST)載體37℃進(jìn)行雙酶切，并將其連接在16℃過(guò)夜。然后將重組體轉(zhuǎn)化到DH5α 中，挑取陽(yáng)性克隆至加入相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，培養(yǎng)后取1 mL菌液送測(cè)序，剩下的菌液保種并提取重組體的質(zhì)粒。

1.4 靶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

按照文獻(xiàn)[16]中所述方法進(jìn)行誘導(dǎo)和裂解，將測(cè)序正確的重組體pGEX4T-Survivin轉(zhuǎn)入至BL21菌株中，經(jīng)37℃培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.55～1.0，在22℃下以0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2 h，收集菌體，取少量的菌體制成SDS-PAGE樣品。將收集的菌體用PBS將菌株懸浮起來(lái)，加PMSF和DTT，然后加溶菌酶30 min，期間要隨時(shí)調(diào)pH至8.0，最后加完Triton離心，去沉淀，取少量上清制成SDS-PAGE樣品，剩下的上清結(jié)合已經(jīng)處理好的柱子，然后將融合蛋白洗脫下來(lái)，取少量制成SDS-PAGE樣品，進(jìn)行SDSPAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組體的制備

對(duì)Survivin基因BIR結(jié)構(gòu)域的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增得到的片段為276 bp，在250～500 bp之間，與預(yù)期的片段大小一致。該片段經(jīng)雙酶切、連接到載體上構(gòu)成重組體，經(jīng)驗(yàn)證該重組體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌中（圖2）。

圖1 Survivin PCR

圖2 菌落PCR驗(yàn)證

2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

Survivin基因的BIR結(jié)構(gòu)域編碼的蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)及谷胱甘肽瓊脂糖親和層析技術(shù)純化的結(jié)果見(jiàn)圖3。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2 h后，菌體中融合蛋白的表達(dá)量顯著增加，離心除去菌體后的上清中也顯示出大量的融合蛋白，從上清中純化出了融合蛋白，約為37 ku。

圖3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

3 討 論

對(duì)Survivin基因N端BIR結(jié)構(gòu)域表達(dá)的研究，通常用真核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，可直接轉(zhuǎn)入瘤細(xì)胞中，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[17-19]。但利用原核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，獲得融合蛋白的報(bào)道似乎很少。殷小濤等[20]將利用PCR擴(kuò)增得到的人Survivin基因的全長(zhǎng)序列(538bp)克隆至原核表達(dá)載體pET28a，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了24 ku的Survivin/His融合蛋白，用Ni親和層析凝膠純化后的蛋白純度達(dá)到90%，且有良好的抗原活性。本實(shí)驗(yàn)也獲得與上述殷小濤等相似的結(jié)果，獲得的Survivin/GST融合蛋白約為37 ku，且表達(dá)量很高。此外，在利用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)時(shí)，溫度是關(guān)鍵因素之一，通常以18～26℃的低溫進(jìn)行誘導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)中以22℃誘導(dǎo)重組體表達(dá)的效果很好，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所采用的條件是適合的。這些結(jié)果對(duì)進(jìn)一步分析Survivin基因BIR功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白及其與IAP家族成員的相互作用有一定的指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：裘永強(qiáng)）

Expression and purification of Survivin gene fusion protein

LI Li, LIU Jing, JIANG Jizhi
(College of Life Sciences of Hebei University, Baoding 071000, china)

Objective Survivin gene is the strongest apoptosis-inhibition factor among inhibitor of apoptosis protein (IAP), and purification of fusion protein of functional domains (baculovirus IAP repeat, BIR) may provide the foundation for interaction research between the gene and related other genes. Methods BIR sequence, after amplification with PCR and validation by Escherichia coli DH5α through pGEX4T-2 vector, was transformed into E. coli BL21. Fusion protein of BIR was induced by IPTG and purified by Glutathione Agarose Affinity Chromatography. Results The amplified fragment BIR was about 276bp, purified fusion protein molecular weight of approximately 37ku. Conclusion PCR results are consistent with the expected fragment size, recombinant plasmids after 2h after IPTG induction, the cell in the fusion protein increase significantly, which provide basis for further research on Survivin gene function and its interacting protein.

Survivin; pGEX4T-2; IPTG induction; purification

R3

A

1674-490X(2014)01-0013-04

2013-11-25

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（13226502D）；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2011201003）

李麗（1988—），女，河北邢臺(tái)人，在讀碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

蔣繼志（1960—），男，寧夏中寧人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail: jizhijiang@163.com