董超，馬新喬，高軍秒，李蕓

（1. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定071000；2. 蠡縣縣醫(yī)院，河北 蠡縣071400；3. 高碑店市醫(yī)院，河北 高碑店074000）

·基礎(chǔ)研究·

血府逐瘀方對動脈粥樣硬化大鼠MMP-2及TIMP-2的影響

董超1，馬新喬2，高軍秒3，李蕓3

（1. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定071000；2. 蠡縣縣醫(yī)院，河北 蠡縣071400；3. 高碑店市醫(yī)院，河北 高碑店074000）

目的 通過研究血府逐瘀方對動脈粥樣硬化大鼠動脈斑塊組織基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2（TIMP-2）表達的影響，探討血府逐瘀方抗動脈粥樣硬化作用的可能機制。方法 將30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、血府逐瘀方組。對照組給予正常飼料，采用腹腔注射維生素D3及飼喂高脂飼料的方法建立大鼠動脈粥樣硬化模型。實驗結(jié)束后，取大鼠主動脈粥樣硬化組織檢測MMP-2和的TIMP-2的表達水平。結(jié)果 HE染色光鏡下顯示，對照組動脈壁形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，模型組動脈內(nèi)膜粗糙，中膜平滑肌增生排列紊亂，血府逐瘀方組形態(tài)介于二者之間；免疫組化觀察，與對照組相比，模型組和血府逐瘀方組MMP-2的表達顯著升高，TIMP-2的表達顯著下降；血府逐瘀方組與模型組相比，MMP-2表達顯著降低，TIMP-2表達顯著升高。結(jié)論 血府逐瘀方能抑制動脈粥樣硬化的形成，其機制可能與其能下調(diào)動脈粥樣硬化大鼠動脈粥樣硬化組織內(nèi)的MMP-2的表達及升高TIMP-2表達有關(guān)。

血府逐瘀方；動脈粥樣硬化；MMP-2；TIMP-2

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是多種因素長期作用下的慢性血管性疾病，流行病學(xué)表明，動脈粥樣硬化在中國的發(fā)病率逐年增高，其引起的心、腦、腎等重要器官的損害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)了較高的病死率和致殘率，嚴重威脅了患者的生命健康。

近年來研究及筆者前期的實驗結(jié)果[1-7]表明，血府逐瘀方可以通過調(diào)節(jié)血脂代謝、內(nèi)皮細胞的活性因子，降低炎癥因子的水平、調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)（ECM）的代謝等起到抗動脈粥樣硬化的作用。但該方對動脈粥樣硬化大鼠組織基質(zhì)蛋白酶2（MMP-2）及其抑制因子2（TIMP-2）表達的影響鮮有報道。該實驗在飼喂SD大鼠過程中給予高脂飼料并用維生素D3腹腔注射的方法制作了動脈粥樣硬化大鼠動物模型，通過免疫組織化學(xué)方法檢測動脈粥樣硬化組織中MMP-2和TIMP-2表達水平，研究該方在動脈粥樣硬化形成過程中的作用和影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量（200±10）g，由河北醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，（動物許可證編號：909047）

1.2 藥品與試劑

VitD3注射液、膽固醇、丙基硫氧嘧啶由上海倍卓生物科技有限公司生產(chǎn)，購自保定市華新試劑公司。兔抗鼠MMP-2和TIMP-2抗體、免疫組化試劑盒均購自北京中杉生物有限公司。血府逐瘀方（草藥購自保定市樂仁堂藥店）[8]嚴格按照該方煎制方法制成含生藥濃度為2 g/mL的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆?。高脂飼料由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 實驗設(shè)備

BCD-133ES冰箱（海爾電器股份有限公司生產(chǎn)）；BMJ-B型生物組織包埋機（常州市中威電子儀器有限公司生產(chǎn)）；A130375型切片機（萊卡儀器設(shè)備有限公司）；HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)（武漢千屏影像技術(shù)有限責任公司）。

1.4 實驗分組及造模

30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、血府逐瘀方組。對照組用普通飼料喂養(yǎng)，模型組及血府逐瘀方組均用高脂飼料喂養(yǎng)[4]。實驗開始后，模型組和血府逐瘀方組大鼠分3 d腹腔注射總劑量為70萬單位的維生素D3[9]。實驗中，對照組飼喂普通飼料，血府逐瘀方組給予高脂飼料喂養(yǎng)的同時每天給予血府逐瘀方混懸液12 g/kg灌胃；模型組每天飼喂高脂飼料同時灌胃等體積的蒸餾水。實驗至第12周。

1.5 病理形態(tài)學(xué)及免疫組化觀察

12周末實驗結(jié)束，3%戊巴比妥鈉麻醉動物（30 mg/kg），剖腹取大鼠主動脈弓至腹主動脈分叉處的主動脈，通過肉眼觀察，取主動脈弓處動脈斑塊較明顯的血管約1 cm，甲醛固定，石蠟包埋, 切片, HE染色觀察。免疫組織化學(xué)法嚴格按照說明書進行操作，檢測MMP-2和TIMP-2表達水平。

1.6 結(jié)果判定

MMP-2和TIMP-2陽性表達為細胞膜/胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)對免疫組化結(jié)果進行分析，每張切片取不同的10個高倍視野（400倍），測量粥樣硬化斑塊陽性視野的面積，取其平均值做為免疫組化陽性結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進行處理，計量資料以x±s表示，多個組間比較使用完全隨機設(shè)計方差分析F檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色光鏡下觀察

對照組動脈管壁各層形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜下未見泡沫細胞（圖1a）。模型組顯示動脈內(nèi)膜粗糙，向管腔內(nèi)稍隆起，內(nèi)膜下可見泡沫細胞，中膜平滑肌增生排列紊亂，彈力纖維融合，可見早期動脈粥樣硬化的形態(tài)改變（圖1b）。血府逐瘀方組動脈內(nèi)膜無明顯增厚，泡沫細胞不明顯，平滑肌細胞排列較規(guī)整（圖1c）。

圖1 各組主動脈病理變化（HE染色×400）

2.2 MMP-2和TIMP-2在動脈粥樣硬化斑塊的表達

模型組與對照組相比，動脈斑塊MMP-2陽性表達程度升高，TIMP-2陽性表達程度降低；血府逐瘀方組與模型組相比，動脈斑塊MMP-2表達顯著降低，TIMP-2表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表1。

圖2 各組動脈內(nèi)膜MMP-2及TIMP-2 免疫組織化學(xué)染色（×400）

表1 各組動脈粥樣硬化組織MMP-2和TIMP-2陽性表達比較(n=10，x±s)

3 討 論

動脈粥樣硬化是在多因素影響下的長期慢性的病變過程，在其發(fā)生發(fā)展的過程中，脂質(zhì)物質(zhì)在內(nèi)膜的沉積、血管內(nèi)膜的損傷、單核細胞被激活并釋放大量的生長因子及細胞活性因子，細胞外基質(zhì)（ECM）代謝失調(diào)等一系列的變化，導(dǎo)致動脈管壁中膜平滑肌細胞（VSMC）大量增殖，并向內(nèi)膜下遷移，形成了動脈粥樣斑塊[10]。

VSMC增殖并從動脈中膜向內(nèi)膜遷移的重要原因是ECM的合成與降解的失衡[11]，因此對于保持ECM合成與降解的平衡是防治動脈粥樣硬化重要的切入點。MMPs是一類能調(diào)節(jié)ECM代謝平衡的重要的蛋白水解酶，正常生理情況下，血管內(nèi)皮細胞不分泌或分泌很少的MMPs，故在血管組織中檢測不到其活性[12]，動脈粥樣硬化發(fā)生過程中，各種病理過程如脂質(zhì)的沉積，巨噬細胞的聚集、活化、局部組織缺血、缺氧等因素的刺激下，受損被激活的內(nèi)皮細胞及浸潤的炎細胞可表達大量的MMPs，其中與動脈粥樣硬化發(fā)生關(guān)系最為密切的是MMP-2[13]，過量的MMP-2可降解基底膜、明膠和多種膠原成分，促進平滑肌的增殖，平滑肌在形成泡沫細胞的過程中又可以繼續(xù)分泌大量的MMP-2，降解ECM，加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展[14]。

在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中， TIMP-2主要由巨噬細胞和上皮細胞產(chǎn)生，它是一種非糖基化蛋白，對MMPs家族尤其是MMP-2有明顯的抑制作用[15]，能延緩和阻止ECM被降解，調(diào)節(jié)ECM的失衡及抑制平滑肌的增殖和遷移，起到抗動脈粥樣硬化的作用。

動脈粥樣硬化在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)診治中沒有明確記載，辨證多將其歸為“血瘀”“痹癥”的范疇；臨床中活血化瘀的治法治療動脈粥樣硬化療效比較顯著，一直是中醫(yī)藥抗動脈粥樣硬化的熱點之一，血府逐瘀方是活血化瘀代表方之一，出于王清任的《醫(yī)林改錯》。筆者前期的研究結(jié)果顯示，本方可通過對脂質(zhì)代謝、血管活性物質(zhì)等的調(diào)節(jié)，起到防治動脈粥樣硬化的作用[3-4]。

本實驗免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，該方可使動脈粥樣硬化斑塊組織中MMP-2表達降低、TIMP- 2表達升高，提示該方能通過調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2的平衡，延緩和阻止ECM被降解，起到抑制動脈粥樣硬化形成的作用。本實驗進一步通過HE染色光鏡下進行形態(tài)學(xué)觀察，血府逐瘀方組動脈管壁動脈內(nèi)膜下泡沫細胞不明顯，平滑肌細胞排列較規(guī)整，較模型組形態(tài)出現(xiàn)明顯改善。證實該方可通過調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2的平衡，抑制ECM的降解過程，發(fā)揮其防治動脈粥樣硬化的作用。

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（責任編輯：劉俊華）

Effects of Xuefu Zhuyu Decoction on MMP-2 and TIMP - 2 in atherosclerotic rats

DONG Chao1, MA Xinqiao2, GAO Junmiao3, LI Yun3
(1. College of Basic Medical Science of Hebei University, Baoding 071000, China; 2. Lixian County Hospital, Lixian 071400, China; 3. Gaobeidian Hospital, Gaobeidian 074000, China)

Objective To explore mechanism of Xuefu Zhuyu Decoction on the expression of matrix metalloproteianse-2(MMP-2) and tissue metalloproteinase inhibitor -2 (TIMP - 2) in atheroselerotic rats. Methods 30 SD rats were randomly divided into the control group, model group and Xuefu Zhuyu Decoction group. Subcutaneous injection vitD3with high fat feeding was conducted to reproduce atheroselerotic rats model. After the experiment, immunohistochemistry staining was performed to detect the level of MMP - 2 and TIMP - 2 protein expression. Results Under light microscope, arterial structure of the control group was completed, artery intima of the model group was rough, the smooth muscle was disordered arrangement, Xuefu Zhuyu Decoction forms was between the two; Compared with the control group, the expressions of MMP-2 was increased significantly and the expressions of TIMP-2 was decreased significantly in in model group and Xuefu Zhuyu Decoction group. Compared with the model group, the expressions of MMP-2 protein in Xuefu Zhuyu Decoction group were decreased significantly, the expressions of TIMP-2 protein were increased significantly.Conclusion The Xuefu Zhuyu Decoction Could downregulate the expressions of MMP-2 and upregulate he expressions of TIMP-2 and inhibit the formation of atherosclerosis.

Xuefu Zhuyu Decoction; Atheroselerosis; MMP-2; TIMP-2

R363

A

1674-490X(2014)03-0001-05

2014-05-11

河北省中醫(yī)藥管理局2011中醫(yī)藥類科研計劃課題（2011107）； 2013年科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃（13ZF019）

董超（1978—），男，河北保定人，講師，碩士，主要從事心血管病理的研究。E-mail：dc4132988@163.com