付紹印，趙宏麗，鄭竹清,2，李金泉,2，張文廣,2,3

1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；

2. 動物遺傳育種與繁殖內(nèi)蒙古自治區(qū)重點實驗室，呼和浩特 010018；

3. 內(nèi)蒙古ATCG生物信息研究所，呼和浩特 010020；

4. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031

褪黑激素對絨山羊皮膚中毛囊周期相關(guān)miRNAs表達模式的影響

付紹印1,2,3,4，趙宏麗1，鄭竹清1,2，李金泉1,2，張文廣1,2,3

1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；

2. 動物遺傳育種與繁殖內(nèi)蒙古自治區(qū)重點實驗室，呼和浩特 010018；

3. 內(nèi)蒙古ATCG生物信息研究所，呼和浩特 010020；

4. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031

褪黑激素(Melatonin, MT)和miRNAs在毛囊的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，但MT對絨山羊皮膚毛囊miRNAs表達模式的影響尚未見報道。為探索MT從miRNAs層次影響山羊絨生長的機制，文章在內(nèi)蒙古絨山羊中實施了褪黑激素埋植試驗：5只青年母羊作為實驗組埋植褪黑激素，另外5只青年母羊作為對照。利用熒光定量PCR檢測褪黑激素埋植前后毛囊周期相關(guān)miRNAs的表達變化。結(jié)果表明，埋植MT明顯改變了6個絨毛相關(guān)miRNAs的表達規(guī)律：在一個絨毛周期內(nèi)，除let-7a外，miR-203、miR-205、miR-96、miR-183和miR-199a的表達量均發(fā)生3次躍遷；埋植MT改變了miRNAs之間的共表達模式。對照組各miRNA之間相關(guān)系數(shù)范圍為 0.87～0.99(P＜0.01)。與對照組相比，埋植組中 let-7a與 miR-96、miR-199a、miR-205，miR-203與miR-96、miR-199a，miR-96與miR-183，miR-183與miR-199a之間的相關(guān)系數(shù)被明顯消弱；MT通過下調(diào)6月份埋植組各miRNA的表達量提早誘發(fā)二次生絨。

褪黑激素；miRNAs；絨山羊；絨毛周期

動物的被毛生長是一個極其復(fù)雜的過程，受營養(yǎng)、環(huán)境、代謝水平以及基因表達調(diào)控等諸多因素的影響[1]。褪黑激素(Melatonin, MT)和miRNAs在毛囊的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。MT是高度保守的吲哚類激素，對多種細胞、組織和器官有非常重要的作用[2]。研究表明，皮膚組織是除松果體外，MT合成與代謝的又一重要場所[3,4]。外源MT能誘發(fā)水貂(Mustlavison)、狐(Vulpes)、毛絲鼠(Chinchilla)、安哥拉兔(Angora)提早長毛[2,5～7]，促進休止期向生長初期毛囊轉(zhuǎn)變、延長生長初期、抑制生長中期轉(zhuǎn)變等[8]。對絨山羊(Capra hircus)的研究也發(fā)現(xiàn)，MT能提高絨毛產(chǎn)量，誘發(fā)二次生絨，提前毛囊生長期[9～11]。但由于絨山羊皮膚組織沒有膜受體MT1、MT2的表達[12]，因此，對MT促絨生長的分子機理尚未見詳細報道。miRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類在轉(zhuǎn)錄后影響基因表達的調(diào)控因子，參與細胞的增殖、凋亡及個體的生長、發(fā)育等幾乎所有的生命過程。關(guān)于miRNA在皮膚毛囊發(fā)育過程中的重要作用也有許多相關(guān)報道，包括參與皮膚毛囊形態(tài)建成、毛囊周期性生長等過程。2006年，Yi等[13]通過構(gòu)建表皮特異性 K-14啟動子條件性敲除了小鼠皮膚祖細胞中合成miRNAs的Dicer酶；敲除Dicer酶的小鼠出生后表型基本正常，但1～2 d體重開始下降，4～6 d產(chǎn)生明顯脫水，胡須發(fā)育畸形；鏡檢發(fā)現(xiàn)在毛囊形成過程中毛囊基質(zhì)不向內(nèi)陷，而是外翻，影響了毛囊的正常形態(tài)發(fā)生。最近，陳玉林等[14]通過Solexa高通量測序發(fā)現(xiàn)，絨山羊絨毛生長的興盛期、褪行期、休止期存在特異表達的miRNAs，提示miRNAs對毛囊生長和發(fā)育發(fā)揮重要的功能。因此，本研究在實驗室前期工作的基礎(chǔ)上，以內(nèi)蒙古白絨山羊為研究對象，持續(xù)埋植MT，時間為1年，選取miR-203、 let-7a、miR-199a、miR-96、miR-183、miR-205等6個毛囊周期相關(guān)的miRNAs，通過熒光定量PCR分析埋植MT前后這些miRNAs的表達變化，以期從miRNAs水平探討MT促絨生長的分子機理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

樣品來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室保存的2008年8月份至2009年7月份采自內(nèi)蒙古白絨山羊種羊場的皮膚樣品。

1.1.2 動物飼養(yǎng)以及樣品收集

相同飼養(yǎng)條件下，根據(jù)絨長、絨細、產(chǎn)絨量、體重，選取體況良好的10只周歲母羊，隨機平均分成兩組，一組埋植MT，一組作為對照。MT埋植期間，每兩個月按照2 mg/kg的劑量在絨山羊耳后皮下埋植MT，次月于肩胛部采集1 cm2大小的皮膚樣品，液氮快速冷凍帶回實驗室，-80℃保存?zhèn)溆?。同一日期夜間12點左右于靜脈處采集血液樣品。

1.2 方法

1.2.1 血液中MT含量測定

將肝素鈉抗凝的新鮮血液樣品2500 r/min離心12 min，抽取上層血漿，用MT放免試劑盒(KIPL3300，Biosource公司)測定血液中的MT濃度。

1.2.2 絨山羊皮膚組織miRNAs的提取及反轉(zhuǎn)錄

皮膚組織 miRNAs提取和分離按照 miRcutemi-RNA提取分離試劑盒(DP501，TIANGEN BIOTECH CO., LTD)說明書進行。提取的小RNA用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，微量紫外分光光度計測定其濃度，小RNA溶液在-80℃保存?zhèn)溆?。OD260/280值在1.8～2.0之間、大小在200 nt以下的小RNA樣品用于后續(xù)miRNAs反轉(zhuǎn)錄合成。

表1 miRNAs定量引物序列

miRNAs cDNA合成按照 TaKaRa公司的 One Step PrimeScript進行。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，包括2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μL、0.1%BSA 2 μL、miRNAPrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL、小RNA 100 ng，用ddH2O補足到20 μL。反應(yīng)條件：37℃60 min；85℃ 5 s。將合成的miRNA第一鏈cDNA稀釋成100 μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 miRNAs的熒光定量引物

參照miRBase19.0山羊、綿羊、牛成熟miRNAs序列，利用primer5.0設(shè)計候選miRNAs以及內(nèi)參5S rRNA定量引物，序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物信息見表1。

1.2.4 miRNAs熒光定量分析

以反轉(zhuǎn)錄得到的miRNAs cDNA為模板，利用ABI MP3005 Real-time PCR 系統(tǒng)(ABI,USA)，參考SYBR Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)試劑盒說明書，采用二步法進行Real-time PCR擴增。擴增條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s，復(fù)性(溫度見表1)45 s，40個循環(huán)；94℃ 30 s，55℃ 30 s至95℃ 30 s連續(xù)掃描，0.5℃作為一個梯度，掃描 0.06 s。反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqTM10 μLⅡ 、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL、ddH2O 8 μL。

1.2.5 統(tǒng)計分析

候選 miRNAs表達水平的計算按照內(nèi)參基因的ΔCT法進行，即相對表達水平=2△CT，其中△CT=CT內(nèi)參基因- CT目的基因。

SAS9.0軟件TTEST過程分別對各個miRNA埋植組與對照組不同月份的表達量進行差異顯著性檢驗。各組內(nèi)miRNA表達量的相關(guān)性分析采用CORR過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液中MT的變化

絨山羊一個絨毛生長周期內(nèi)夜間血漿中MT的水平如圖1所示。結(jié)果表明，對照組血漿中MT水平在7～30 pg/mL之間，而埋植組血漿中MT平均濃度高達150.77 pg/mL，平均高出對照組10.4倍。

2.2 埋植MT后絨毛生長變化

圖1 夜間血漿中MT含量(pg/mL)

圖2 各月份羊絨長度

每月剪取受試羊群體側(cè)肩胛部絨毛樣品，測定絨毛長度，觀察分析絨毛變化(圖2)。埋植MT后絨毛長度變化并不顯著，但伴有提早二次生絨的現(xiàn)象(6月埋植組絨毛提前長出體表2～3 cm)，5月為抓絨期，無絨毛長度記錄。

2.3 絨毛生長相關(guān)miRNAs在絨山羊皮膚組織中的表達

選取5S rRNA為內(nèi)參基因，埋植組與對照組各miRNA不同月份的相對表達量見表2，變化規(guī)律見圖3。

埋植MT各候選miRNA均發(fā)生了顯著的變化(P＜0.05)。埋植MT后miR-203在9、10、12、2、3、4、5、7月的表達量顯著升高，let-7a的表達量在9、12、2、3、4、7月發(fā)生了顯著上調(diào)，miR-205的表達量在9、10、2、3、4、7月顯著升高，miR-96則是 10、2、3、4、7月顯著上調(diào)，miR-183和miR-199a除9、3、4、7月發(fā)生顯著共同上調(diào)外，miR-183在12、2月以及miR-199a的10月也發(fā)生了明顯升高；而所有6個miRNAs均在11、1、6月發(fā)生顯著降低，另外miR-183在8月以及miR-199a在12月也發(fā)生了顯著降低；其他月份變化不明顯(P＞0.05)。

對照組中，除miR-199a外，miRNAs的表達量均是8、9月基本保持不變，10月開始上升，11月達到全年的最高峰，然后緩慢下降，在2、6月又出現(xiàn)兩個微小的波峰，miR-199a除12月達到全年最高峰外，規(guī)律與其他miRNAs基本一致；埋植組中，miR-203、miR-205、miR-183自MT埋植以后就開始緩慢上升，并在全年內(nèi)出現(xiàn) 3個明顯的表達波峰，分別是10、12、2月，所不同的是miR-183全年處于較低水平。let-7a在絨毛生長的一個周期內(nèi)，其表達規(guī)律與 miR-203、miR-205、miR-183基本一致，只發(fā)生了微小的變化：埋植MT以后，從8月到12月一直緩慢上升，1月急劇下降后 2月又快速升高達到全年的最高點，然后急劇下降并一直保持較低水平。miR-96、miR-199a埋植MT以后均是將全年的表達最高峰提前到10月，另外在12月、2月也出現(xiàn)了小的波峰。

總之，除let-7a外，MT使miR-203、miR-205、miR-96、miR-183、miR-199a的表達躍遷點發(fā)生了3次變化。

2.4 埋植組和對照組內(nèi)各miRNA相關(guān)性變化

利用SAS分析兩組各miRNA間的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。從表3可以看出，對照組各miRNA之間相關(guān)系數(shù)范圍為 0.87～0.99(P＜0.01)，說明絨毛生長的不同時期各個 miRNA具有非常相似的表達模式。與對照組相比，埋植MT明顯消弱了let-7a與miR-96、miR-199a、miR-205，miR-203與miR-96、miR-199a，miR-96與miR-183，miR-183與miR-199a之間的相似性(P＞0.05)，這提示MT可能是通過降低絨毛相關(guān)miRNAs的協(xié)同作用進而影響絨毛生長周期。埋植前后各miRNA相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)變化見圖4。

2.5 miRNAs表達變化與提早生絨的關(guān)系

6月處于絨毛生長的前期，毛囊活性剛剛啟動，沒有絨毛長出體表。然而埋植MT改變了這種生長模式，提早誘發(fā)二次生絨。本研究結(jié)果表明，埋植MT后，miR-203、let-7a、miR-205、miR-96、miR-183、miR-199a的表達量分別為對照組的 1/5、1/6、2/9、1/4、1/5、4/9，提示MT通過下調(diào)這些miRNAs的表達進而提前誘發(fā)絨毛生長。

3 討 論

圖3 miRNAs在不同實驗組絨山羊皮膚中的變化規(guī)律

表3 埋植組和對照組各miRNA間相關(guān)系數(shù)

圖4 埋植前后相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)變化圖細線表示埋植改變的miRNA相互關(guān)系，粗線表示埋植未改變的miRNA相互關(guān)系。

國內(nèi)外的研究均表明，MT作為誘因能夠促進絨毛的生長，提高絨產(chǎn)量，而miRNAs作為一類新的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在皮膚毛囊周期發(fā)育過程發(fā)揮重要的作用。這就預(yù)示二者之間以相互聯(lián)系的方式共同作用于皮膚毛囊周期，進而影響絨毛生長，然而關(guān)于MT對皮膚毛囊miRNAs表達模式的影響尚未見報道。本研究通過外源埋植MT，分析皮膚毛囊及絨毛周期相關(guān)miRNAs的表達規(guī)律，結(jié)果表明，埋植MT明顯增加了夜間血液中MT的含量，顯著改變了候選miRNAs的表達規(guī)律，這說明MT可以以miRNAs為介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控皮膚毛囊及絨毛周期。絨山羊次級毛囊周期為 1年。經(jīng)典的毛囊周期劃分為：4～11月份為生長期，12～1月份為退行期，2～3月份為休止期[15]，其中5～8月為次級毛囊生長前期，絨毛緩慢生長，9～11月為毛囊生長期，絨毛快速生長，11月絨毛生長最快。而從對照組miRNA的表達規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，各miRNAs 4～8月均處于較低水平，9～11月開始緩慢升高，11月到達全年最高水平，然后緩慢下降，在 2月出現(xiàn)另一個小的峰值。這就表明miRNAs的表達對絨毛周期的轉(zhuǎn)換發(fā)揮至關(guān)重要的作用，為我們通過miRNAs來研究MT促絨生長提供了理論依據(jù)。

Let-7是最早被發(fā)現(xiàn)的miRNA之一[16]，它廣泛參與調(diào)控動植物的時序發(fā)育。let-7的表達具有時間特異性，當(dāng)細胞開始分化時，let-7的表達量開始迅速增加[17]。目前已有許多l(xiāng)et-7 miRNAs參與動物組織器官發(fā)育調(diào)控的報道；miR-203是一類角質(zhì)化細胞特異的miRNA[18]，它在抑制細胞的增殖、促進細胞的終末端分化方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用；miR-96作為miR-183家族成員之一，與miR-183以共轉(zhuǎn)錄的方式共同調(diào)控細胞的增殖與分化；miR-199a在腎臟癌中通過靶向 GSK-3β控制細胞的增殖[19]。因此，從miRNAs功能的角度來看，這些miRNAs可以通過協(xié)同的方式調(diào)控細胞的增殖與分化。在這次研究中，通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，正常的絨毛周期內(nèi)，同一月份各miRNA的表達量雖然存在變化，但全年內(nèi)的變化規(guī)律基本一致，即 4、5、6月表達量保持較低水平并緩慢上升，在 7月出現(xiàn)一個突然下降后，再次升高，8、9月基本保持不變后開始急劇上升，于 11月到達全年的最高水平后快速下降，2月出現(xiàn)又一個高峰后，3月到達全年最低水平。這種miRNAs表達模式的相似性通過對照組各miRNA之間的相關(guān)性分析也得了證實(對照組各miRNA之間相關(guān)系數(shù)范圍為0.87～0.99，P＜0.01)。然而，埋植MT明顯改變了這種相似的表達模式。MT顯著消弱了let-7a與 miR-96、miR-199a、miR-205，miR-203與miR-96、miR-199a，miR-96與miR-183，miR-183與 miR-199a的相關(guān)性(表3)。人、小鼠、大鼠等的研究證實，miR-96、miR-183屬于同一個miRNA家族，它們以共轉(zhuǎn)錄的方式調(diào)控細胞的增殖和分化。在山羊中，miR-96、miR-183的前體位于4號染色體1kb的基因簇中(miR-96，Chr.4：91111638-91111715；miR-183，Chr.4：91111879-91111980；)，因此山羊中 miR-96、miR-183可能也是以共表達的方式發(fā)揮作用，這在對照組中得到了證實(rmiR-96/miR-183=0.98，P＜0.0001)。埋植 MT明顯改變了二者的相互關(guān)系，尤其是10月份，對照組二者表達量基本一致，但埋植MT后miR-96的表達量比miR-183高20倍左右，二者表達量比值的改變可能對絨毛生長發(fā)揮重要的調(diào)控作用。另外，在內(nèi)蒙絨山羊的毛囊周期循環(huán)過程中，6月屬于興盛前期，毛囊活性剛剛啟動，未見絨毛長出體表。然而，埋植MT改變了這種變化趨勢，埋植組6月絨毛已經(jīng)長出體表2～3 cm，而與之對應(yīng)的是6月各miRNA的表達量均發(fā)生顯著下調(diào)，因此表明在6月MT通過下調(diào)各miRNA的表達進而提早誘發(fā)二次生絨。

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(責(zé)任編委: 李明洲)

Melatonin regulating the expression of miRNAs involved in hair follicle cycle of cashmere goats skin

Shaoyin Fu1,2,3,4, Hongli Zhao1, Zhuqing Zheng1,2, Jinquan Li1,2, Wenguang Zhang1,2,3

1.College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China;
2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010018, China;
3. Institute of ATCG, Nei Mongolia Bio-Information, Hohhot 010020, China;
4. Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031, China

Melatonin and microRNAs (miRNAs) play important roles in regulating hair follicle development. However, the effect of melatonin on the expression pattern of miRNAs in skin and follicle of cashmere goats remain largely undefined. To explore the mechanism of melatonin affecting cashmere growth mediated by miRNAs, the effect of melatonin implants administered in Nei Mongol cashmere goats was assessed. In the experiment, five yearlingdoes were implanted with melatonin, with the remaining other five females as control group. The expression of six candidate miRNAs was quantified by reverse transcription-real time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The results indicated that melatonin significantly altered the expression pattern of miRNAs. Except for let-7a, the expression levels of miR-203, miR-205, miR-96, miR-183 and miR-199a occur three transitions during a cashmere cycle; melatonin changed the co-expression pattern of miRNAs. The correlation coefficient between miRNAs is 0.87-0.99 in control group(P＜0.01). Compared with the control group, the correlation coefficient between some miRNAs (let-7a and miR-96, miR-199a, miR-205;miR-203 and miR-96, miR-199a; miR-96 and miR-183; miR-183 and miR-199a) was significantly weakened in melatonin group. Melatonin might induce second growth of cashmere mediated by down-regulating the expression level of some miRNAs in June in melatonin implanted group.

melatonin; miRNAs; cashmere goats; cashmere cycle

2014-05-04;

2014-08-11

國家科技支撐項目(編號：2011BAD28B05)和國家自然科學(xué)基金項目(編號：31260538)資助

付紹印，博士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: fushao1234@126.com

張文廣，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：數(shù)量基因組學(xué)暨性狀遺傳機理。E-mail: atcgnmbi@aliyun.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1235

時間: 2014-9-28 14:34:24

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140928.1623.006.html