李峰利，狄佳春，趙亮，陳旭升

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南京 210095；

2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點實驗室，南京 210014

陸地棉皺縮葉突變體基因wr3的初步定位

李峰利1，狄佳春2，趙亮2，陳旭升2

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南京 210095；

2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點實驗室，南京 210014

陸地棉皺縮葉突變體是本項目組自主發(fā)現(xiàn)的一種自然突變體。前期對其表型性狀的觀察發(fā)現(xiàn)該突變體的農(nóng)藝性狀有別于前人已報道的皺葉突變體；通過陸陸雜交世代群體對其遺傳規(guī)律的研究表明，皺縮葉突變性狀是受一對完全隱性基因wr3控制的質(zhì)量性狀。文章以皺葉突變自交系L037和海7124為親本配置組合得到的海陸雜交F2為作圖群體，利用本實驗室遴選的平均覆蓋棉花26對染色體上的234對SSR引物(每染色體相對等距離分布9對引物)，通過對雙親以及近等基因池的篩選，共得到12對多態(tài)性引物。用這些引物檢測F2作圖群體每個單株的標(biāo)記基因型，經(jīng)Join Map 4.0分析顯示，位于Chr.21的引物BNL3279與目的基因連鎖，二者間的遺傳距離為28.7 cM。隨后對Chr.21上的其他引物進一步篩選，共得到16對與目的基因連鎖的標(biāo)記，其中與目的基因距離最近的標(biāo)記NAU3740的遺傳距離為4.8 cM，另一側(cè)標(biāo)記cgr5428的遺傳距離為10.4 cM。由此推定，皺縮葉突變體基因wr3在棉花第21染色體上。

陸地棉；皺縮葉突變體；基因定位；SSR；BSA分析法

皺葉突變體性狀表現(xiàn)明顯，表型穩(wěn)定，受環(huán)境的影響較少，易于識別、分組和計數(shù)，在突變體庫的構(gòu)建和經(jīng)典遺傳學(xué)基因定位中具有重要作用。國外在 20世紀(jì)已有關(guān)于棉花皺葉突變體的報道。Harland[1,2]和Hutchinson等[3]分別在海島棉和陸地棉中發(fā)現(xiàn)了“矮皺突變體”，突變體的皺葉性狀與植株的矮化特征伴隨發(fā)生，遺傳分析表明，兩個矮皺突變體均是受1對隱性基因控制的質(zhì)量性狀。Turcotte等[4]報道在Pima棉F3株系后代中發(fā)現(xiàn)1個受1對顯性基因 Ru控制的皺葉突變體。Kohel[5]在陸地棉中發(fā)現(xiàn)另一種皺葉突變，遺傳分析顯示，該突變體受1對顯性基因Crp控制。Dilday等[6]運用等位性與連鎖測試分析了陸地棉一系列的葉型突變體，發(fā)現(xiàn)在第15染色體上的單基因位點皺葉(cr)和另2個復(fù)等位基因位點即帶狀葉(s)和葉脈融合突變(vf)緊密連鎖。Turcotte等[7]報道在海島棉栽培種PimaS-4中發(fā)現(xiàn)了一種葉片極度皺縮突變體，該突變受 1對隱性基因 wr1控制。之后，Turcotte[8]報道在海島棉中發(fā)現(xiàn)第2個皺葉突變，該皺葉突變也受1對隱性單基因控制；研究顯示該皺葉突變基因與早前報道的突變基因 wr1不等位，顯示其為一個新突變，基因符號定為wr2。Kohel報道在陸地棉變種Rex中發(fā)現(xiàn)一種新的皺葉突變，該突變體活力很低，呈半矮生狀態(tài)，表型性狀在開花前呈現(xiàn)，且隨著植株生育期的推進，葉片皺縮程度不斷加強。遺傳研究顯示，該突變性狀受1對單隱性基因rx控制[9]。

國內(nèi)簡桂良等[10]報道，1985年新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團一農(nóng)科所技術(shù)員發(fā)現(xiàn) 1株皺葉海島棉，該海島棉子葉較小，葉片變厚，第1、2片真葉不皺縮或輕微皺縮，葉片缺刻淺，第 3片真葉以后的葉片、葉肉全部皺縮。戴日春[11]在陸地棉新黃綠苗突變體浙12-12N的遺傳鑒定中提到，用黃綠苗突變體與浙農(nóng)皺縮葉突變體等材料雜交，但沒有更多關(guān)于浙農(nóng)皺縮葉突變體的后續(xù)深入研究報道。陳旭升等[12]報道在陸地棉中發(fā)現(xiàn)一個新的皺葉突變體，該突變體成熟植株的株高比正常葉植株還要略高，皺葉性狀約從第8片果枝葉開始表達，而后從下到上逐漸明顯，直至生育期結(jié)束，這與Turcotte在海島棉中報道的2個皺葉突變在表達時序上存在明顯的差異。采用陸陸雜交群體遺傳研究顯示，該突變體是受一對隱性基因控制的質(zhì)量性狀；為區(qū)別 Turcotte報道的皺縮葉，擬將其基因符號定為wr3。

迄今關(guān)于棉花皺縮葉突變體的公開研究報道多局限于經(jīng)典遺傳學(xué)方法進行遺傳分析與連鎖測驗，僅明確這些突變性狀的受控基因是單基因還是雙基因、顯性還是隱性基因。關(guān)于皺葉性狀的基因定位報道較少。本研究擬采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對陸地棉 wr3基因進行染色體初步定位，旨在為進一步的精細定位和克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以正常葉海島棉品種“海7124”為母本，陸地棉皺縮葉突變體自交系“L037”為父本進行雜交獲得F1。然后以F1自交獲得的F2分離群體為作圖群體，用于皺縮葉基因wr3的初步定位。

1.2 方法

1.2.1 PCR 擴增及產(chǎn)物檢測

所有親本和群體單株的DNA提取參考Paterson等[13]方法。利用本實驗室遴選的多態(tài)性較好且平均覆蓋棉花26對染色體上的234對SSR引物(每染色體相對等距離分布9對引物)，參照張?zhí)煺娴萚14]的方法進行PCR擴增。PCR反應(yīng)在PTC-200(MJ research)上進行。擴增結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)恒壓 200 V 非變性PAGE凝膠電泳，凝膠濃度8%～10%，電泳緩沖液為1×TBE，電泳結(jié)束后，參照張軍等方法進行染色[15,16]。1.2.2 目的基因的染色體定位

在F2群體中隨機選取皺縮葉植株和正常葉植株各10株，用scandrop250超微量核算蛋白測定儀測定各DNA的濃度，統(tǒng)一稀釋成40 ng/μL后，吸取等量的DNA分別混合，作為近等基因池。利用234對引物對作圖親本和F2近等基因池進行 PCR 擴增，篩選出具有多態(tài)性的引物。然后，用多態(tài)性引物檢測 F2群體150個單株的標(biāo)記基因型，連鎖分析得到與目的基因連鎖的引物，從而鎖定目標(biāo)染色體。合成目標(biāo)染色體上的SSR引物進行加密，以實現(xiàn)目的基因的初步定位。

統(tǒng)計多態(tài)性條帶，與皺葉L037帶型相同的個體記為“1”，與海7124帶型相同的個體記為“2”，共顯性雜合帶型記為“3”，缺失記為“0”。然后，進行 χ2適合性測驗，驗證標(biāo)記分離比例是否符合孟德爾遺傳規(guī)律。利用 JoinMap 4.0[17]進行連鎖分析，LOD值為3，用Kosambi 作圖函數(shù)計算標(biāo)記間的遺傳距離(cM)。

2 結(jié)果與分析

2.1 皺縮葉突變體的表型特征及其F2群體分離規(guī)律

皺縮葉性狀在苗期不表現(xiàn)，該突變性狀出現(xiàn)的時間約在第 8果枝葉后，在初花期表達明顯，而后出現(xiàn)的其他果枝節(jié)位均表現(xiàn)為皺葉，而且由下到上葉片皺葉性狀表達逐漸明顯。皺葉會導(dǎo)致部分葉片局部失綠，有些葉表面表現(xiàn)類似燙傷的皺縮狀，表面有泡狀突起，部分葉片加厚呈革質(zhì)狀(圖1)。

圖1 皺縮葉突變體不同果枝葉的表型特征葉片編號由 1到 10，代表同一棉株由下到上不同果枝葉的表型特征。1、2為第8果枝葉之前的正常葉片，3～10為第8果枝葉以后的皺縮葉片。

在皺縮葉性狀明顯表達的初花期，對海7124與L037雜交的F2群體表型性狀進行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，F(xiàn)2群體共計 150株，其中表現(xiàn)皺縮葉性狀的隱性個體共43株，正常葉個體共107株?？ǚ竭m合性測驗結(jié)果顯示，雜交 F2的分離擬合正常葉:皺縮葉=3:1的分離比例(χ2=0.334＜χ20.05,1=3.84)，符合孟德爾遺傳規(guī)律。以上結(jié)果表明，皺縮葉突變體是受1對完全隱性基因控制的質(zhì)量性狀。與本項目組前期在陸地棉中的研究結(jié)果一致[12]。

2.2 SSR標(biāo)記的多態(tài)性篩選和目的基因wr3的染色體定位

利用234對引物對親本皺葉L037和海7124進行 PCR 擴增，最終獲得了 169對多態(tài)性引物，多態(tài)率為72.22 %。依據(jù)BSA法，采用上述引物對F2近等基因池進行二次篩選，共得到12對多態(tài)性引物，多態(tài)率為3.13%。

以這12對多態(tài)性引物檢測 F2作圖群體每個單株的標(biāo)記基因型，對電泳條帶的數(shù)據(jù)做連鎖分析，結(jié)果顯示共顯性標(biāo)記BNL3279與目的基因連鎖，兩者間的遺傳距離為28.7 cM。對照Zhao等[18]發(fā)表的高密度棉花遺傳圖譜，標(biāo)記BNL3279位于Chr.21(D11)上。隨后合成了該染色體目標(biāo)區(qū)段的SSR引物，通過對親本的篩選得到24對多態(tài)性引物。以這些引物檢測F2作圖群體每個單株的基因型并做連鎖遺傳分析，結(jié)果顯示，共有16對SSR標(biāo)記與目標(biāo)基因wr3發(fā)生連鎖，它們分別為標(biāo)記 BNL2895、NAU4026、NAU4855、NAU0984、Gh132、NAU6315、BNL3279、CIR077、 NAU6697、 NAU6593、 NAU6658、NAU3740、cgr5428、BNL2650、NAU2016和NAU429(圖2)。其中，標(biāo)記NAU3740與目的基因的遺傳距離4.8 cM，另一側(cè)標(biāo)記cgr5428與目的基因的遺傳距離為10.4 cM，由此推斷，皺縮葉突變體基因wr3在棉花Chr.21(D11)上。

3 討 論

由于突變體在作物遺傳、品種改良、基因定位、基因分離與鑒定以及基因表達與調(diào)控等研究中均具有重要的意義，因此構(gòu)建和篩選突變體庫顯得尤為重要，并成為國內(nèi)外研究的熱點。擬南芥大規(guī)模突變體庫中已包含22 5000個T-DNA插入突變體[19]，水稻中也有超過20 0000個插入標(biāo)簽側(cè)翼序列[20]。相對于擬南芥和水稻，棉花突變體庫的構(gòu)建仍處于初級階段。

自然突變具有不定向、突變譜廣等特點，是獲得突變材料的重要途徑，可以為突變體庫的構(gòu)建提供重要原始材料。目前已正式鑒定的異源四倍體棉花質(zhì)量性狀基因約計200個(包括重疊基因)，其中包括紅株、亞紅株、植株矮化等各種突變型[21～23]。異源四倍體棉種的質(zhì)量基因連鎖群見諸報道的有 18個，其中12個已經(jīng)與特定的染色體相聯(lián)系，分別是第 1、3、4、5、6、7、12、15、16、18、20和 26染色體[24]。

圖2 皺縮葉突變體基因wr3的連鎖圖譜A：為Zhao等已發(fā)表的海陸種間Chr.21遺傳圖；B：為皺縮葉突變體基因wr3的定位連鎖圖。

本研究以陸地棉中自主發(fā)現(xiàn)的皺縮葉突變體為實驗材料，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，成功地將 wr3基因定位在NAU3740和cgr5428之間，從分子遺傳學(xué)水平將目標(biāo)基因定位在棉花Chr.21(D11)上。該研究成果有兩方面科學(xué)意義：(1) 目標(biāo)性狀的成功定位可以為棉花第 21染色體質(zhì)量性狀基因連鎖群的構(gòu)建提供一個新路標(biāo)。該皺縮葉突變體作為一個新的形態(tài)學(xué)標(biāo)記可用于棉花突變體庫的構(gòu)建，突變體本身也可以作為對性測驗和連鎖測驗的遺傳材料被利用；(2) 目的基因的成功定位可為未來對該基因的精細定位與克隆提供參考依據(jù)，也可為控制皺縮葉性狀的關(guān)鍵基因的挖掘、分離和功能分析及其生理生化機理的研究提供科學(xué)指導(dǎo)。

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(責(zé)任編委: 李付廣)

Mapping of a new wrinkled leaf (wr3) gene in upland cotton

Fengli Li1, Jiachun Di2, Liang Zhao2, Xusheng Chen2

1. Agronomy College of Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Key Laboratory of Cotton and Rape in the Lower Reaches of the Yangtze River, Ministry of Agriculture, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China

The phenotype of a wrinkled leaf mutant in upland cotton newly found was different from other analogous mutants reported previously. Genetic analysis indicates that the mutation is controlled by a single recessive gene wr3. In this paper, an F2mapping population derived from the mutation inbred line L037 crossing with Hai7124 (Gossypium babardense) was used. A total of 12 pairs of polymorphic primers were selected from 234 pairs of SSR primers obtained before, which covered 26 pairs of cotton chromosomes at regular intervals. Genetic mapping of the F2population showed that gene wr3was linked to the primer BNL3279 on Chr.21 with the distance of 28.7 cM. Further screening of other primers on Chr.21 showed that gene wr3was flanked by the primers NAU3740 and cgr5428, with genetic distance of 4.8 cM and 10.4 cM, respectively.

Gossypium hirsutum; wrinkled leaf mutant; gene mapping; SSR; bulked segregation analysis

2014-06-04;

2014-08-26

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項子課題(編號：2011ZX08005-001)和轉(zhuǎn)基因特色專用棉新品種培育項目(編號：2011ZX08005-005)資助

李峰利，碩士研究生，研究方向：棉花分子遺傳育種。E-mail: 776840727@qq.com

陳旭升，研究員，研究方向：棉花遺傳育種。E-nail: njcxs@126.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1256

時間: 2014-9-28 14:30:04

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140928.1623.005.html