付言峰，周艷紅,，王愛國，李蘭，劉紅林，李碧俠，任守文

1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，動物品種改良和繁育重點實驗室，南京 210014；

2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095；

3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；

4. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；

5. 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014

梅山豬胚胎附植期EphB2的組織表達及RNA-seq分析

付言峰1，周艷紅1,2，王愛國3，李蘭4,5，劉紅林2，李碧俠1，任守文1

1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，動物品種改良和繁育重點實驗室，南京 210014；

2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095；

3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；

4. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；

5. 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014

豬產(chǎn)仔數(shù)是一個重要的經(jīng)濟和繁殖性狀，而胚胎附植是影響豬產(chǎn)仔數(shù)的重要因素。為了研究促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞受體B2 (EphB2)對豬胚胎附植過程中子宮內(nèi)膜遷移和粘附活動的影響，文章以太湖流域梅山豬為研究對象，利用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)方法，檢測EphB2基因在梅山豬胚胎附植前、中、后期子宮內(nèi)膜附植點/非附植點和卵巢組織的mRNA和蛋白表達譜，并用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)方法分析了不同附植時期子宮內(nèi)膜附植點和卵巢組織的差異表達基因。qRT-PCR和 Western blot結(jié)果表明，EphB2在胚胎附植前、中、后期子宮內(nèi)膜附植點和非附植點的mRNA和蛋白均呈現(xiàn)先升高后降低的表達趨勢，且附植中期的表達量顯著高于前期和后期(P＜0.01)；EphB2在附植前、中、后期卵巢中的mRNA和蛋白表達趨勢則相反，為先降低后升高，且不同時期間表達差異顯著(P＜0.05)。RNA-seq結(jié)果表明，EphB2在子宮內(nèi)膜附植點的mRNA表達，附植中期極顯著高于附植前期(P＜0.01)；EphB2在卵巢的mRNA表達，附植中期顯著高于附植后期(P＜0.05)。綜上所述，EphB2很可能在豬胚胎附植過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，為潛在的豬產(chǎn)仔數(shù)性狀候選基因。

EphB2；胚胎附植；表達；轉(zhuǎn)錄組測序；梅山豬

產(chǎn)仔數(shù)是母豬的重要繁殖性狀，是豬育種工作的重要指標。要提高產(chǎn)仔數(shù)，豬的高排卵數(shù)是基礎(chǔ)，而胚胎成活率是關(guān)鍵。一般認為，豬妊娠早期(10～30 d)是胚胎死亡的高峰期，約占總胚胎死亡率的60%～70%[1,2]。而豬的胚胎附植開始于妊娠第13 d，結(jié)束于妊娠第24 d[3,4]。由此可見，豬的胚胎附植期(妊娠13～24 d)是影響豬產(chǎn)仔數(shù)的一個非常關(guān)鍵的時期，如何減少這一時期胚胎的死亡成為當前亟待解決的問題。

研究表明，Eph-Ephrin系統(tǒng)在人[5,6]、小鼠[7]和大白豬[8,9]的胚胎附植過程中發(fā)揮著重要作用。EphB2作為Eph-Ephrin家族中的受體成員之一，在多種細胞的遷移和粘附活動中發(fā)揮作用。研究表明，EphB2的過量表達會使人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的粘附能力降低，并使細胞的侵入能力增加[10]。EphB2在人的前列腺癌細胞遷移和正常組織結(jié)構(gòu)維護方面發(fā)揮著必不可少的作用[11]，EphB2利用獨立的信號通路調(diào)控人腸上皮細胞的遷移和侵入性增殖，其中細胞遷移是非激酶依賴的通路，而細胞增殖是激酶依賴通路(Ab1-cyclin D1)[12]。

但到目前為止，人們對EphB2在胚胎附植期的時空表達規(guī)律、組織表達譜和基因功能等內(nèi)容還知之甚少。所以，本研究以中國太湖豬的典型類別梅山豬為研究對象，采用實時熒光定量PCR方法和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測胚胎附植前、中、后期 EphB2基因在子宮內(nèi)膜等組織中的 mRNA和蛋白表達趨勢，并用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)方法對EphB2進行差異表達分析。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

9頭胎齡相近(5～7胎)、體重相近(80～100 kg)的半同胞梅山豬母豬來自江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院梅山豬保種場。對其進行單圈飼養(yǎng)，使之自由采食及飲水。適時進行同期發(fā)情和人工授精(間隔12 h左右重復(fù)授精2～3次，相同種公豬精液)。以最后一次配種為0 d計，分別在配種第13 d(附植前期)、18 d(附植中期)和24 d(附植后期)，分別屠宰3頭健康的、體況基本一致的母豬。每頭豬采集3種繁殖組織樣(子宮內(nèi)膜附植點、子宮內(nèi)膜非附植點和卵巢)，之后迅速置于液氮中冷凍保存。另外，空懷豬1頭(配種后13 d)和妊娠豬(95 d )1頭作為對照實驗。

表1 EphB2基因引物序列及PCR擴增條件

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

豬 EphB2基因(GenBank登錄號: XM_ 003481993) cDNA 全長4033 bp，編碼序列(CDS)范圍為1～2949 bp。采用Primer Premier 5. 0 和Oligo 6軟件設(shè)計EphB2和內(nèi)參基因GAPDH的qRT-PCR 引物。引物由上海英濰捷基(Invitrogen)生物公司合成(表1)。

1.2.2 qRT-PCR

首先提取組織樣中的總RNA(TRIzol, Invitrogen)，然后將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit，BBI)，再將cDNA樣品稀釋8倍作為模板進行檢測(Step one plus型熒光定量PCR儀，ABI)。擴增體系為20 μL：SybrGreenqPCR Master Mix (2X) (ABI, America) 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 7 μL，模板(cDNA) 1 μL。 PCR擴增程序：(1) 95℃ 2 min熱啟動HotStarTaq酶活性；(2) 融解95℃ 10 s，復(fù)性/延伸 60℃ 40 s，共 40 循環(huán)；(3) 45～95℃，讀板時0.1℃/s 進行溶解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參基因(GenBank登錄號：NM_001206359)，以交配后未妊娠豬(non)和妊娠第95 d豬(95 d)作為對照。qRT-PCR的數(shù)據(jù)利用2-ΔΔCt法分析。

1.2.3 蛋白提取和Western blot

切取0.1 g組織樣(子宮內(nèi)膜附植點/非附植點、卵巢)剪碎，加入PBS洗滌兩次，2000 r/min離心10 min，棄上清。加入400 μL蛋白裂解液(0.05 mol/L Tris?HCl、 NaCl 8.76 mg/mL、1% TritonX-100、100 μg/mL PMSF)，置于勻漿器上30 s，冰上放置10～15 min。取組織樣勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL預(yù)冷的離心管，10 000 r/min、4℃離心5 min。取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，即為全蛋白提取物。提取出的總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒(Invitrogen, USA)檢測。Western blot過程參考文獻[8,13]，步驟包括SDS-PAGE電泳(Western blot電泳儀，Bio-Rad)、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(EphB2 goat polyclonal antibody against human (A-15)，Santa cruz)、二抗孵育、DAB顯色和ECL曝光。

1.2.4 RNA-seq

本研究采用Illumina Hiseq2000測序平臺的雙端100 bp測序模式對梅山豬子宮內(nèi)膜附著點和卵巢組織樣進行高通量測序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過引物與adaptor序列去除，最終保留高測序質(zhì)量的堿基片段。保留的測序序列(Remained reads)片段用于后續(xù)RNA-seq項目分析模塊的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 qRT-PCR檢測EphB2 mRNA表達

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，提取的總RNA非常完整，無降解，且含量較高，保證了后續(xù)相關(guān)實驗的可靠性。

在豬胚胎附植前(妊娠第13 d)、中(妊娠第18 d)和后期(妊娠第24 d)，利用實時定量PCR法在子宮內(nèi)膜(又分為附植點和非附植點)和卵巢中均檢測到EphB2的mRNA表達，且mRNA表達量會隨著附植的進行而發(fā)生相應(yīng)的變化。

在豬子宮內(nèi)膜附植點和非附植點，EphB2在胚胎附植期(第13～24 d)的mRNA表達趨勢基本保持一致，都是先升高后降低，且妊娠第18 d的表達量極顯著高于其他妊娠日齡(P ＜ 0.01)。在未妊娠豬中，EphB2的表達量很低，僅略高于妊娠第24 d。在妊娠第95 d中，EphB2的表達量第二高，僅低于妊娠第18 d。

在卵巢中，EphB2在胚胎附植期的mRNA表達趨勢為先降低后升高，且妊娠第 18d的表達量顯著低于其他妊娠日齡(P＜0.01)。這與子宮內(nèi)膜中的表達趨勢相反。在未妊娠豬和妊娠第95 d豬的卵巢中，EphB2的表達量均很高(圖1)。

圖1 qRT-PCR方法檢測梅山豬胚胎附植期不同組織中EphB2 mRNA表達譜(GAPDH為內(nèi)參基因)A：不同妊娠日齡；B：同一妊娠日齡 (18 d)。柱形圖上不同的小寫字母或“*”表示差異顯著水平為0.05 (P＜0.05)，不同的大寫字母或“**”表示差異顯著水平為0.01 (P＜0.01)。non：空懷豬。

另外，同一胚胎附植時期(妊娠第18 d)，子宮內(nèi)膜附植點的表達量極顯著高于子宮內(nèi)膜非附植點和卵巢組織(P＜0.01)。這些結(jié)果表明，EphB2在豬胚胎附植調(diào)控中可能發(fā)揮了一定的作用。

2.2 Western blot檢測EphB2蛋白表達

在豬胚胎附植早(13 d)、中(18 d)、晚期(24 d)，EphB2在子宮內(nèi)膜附植點和非附植點的蛋白表達曲線均呈先升高后降低的趨勢，即在胚胎附植早期至中期的過程中表達量持續(xù)升高，在胚胎附植中期至晚期的過程中表達量持續(xù)降低。其中妊娠第18 d的表達量最高，其次為第13 d的表達量，最低的是妊娠第24 d的表達量，且3個妊娠日兩兩間的表達量差異均極顯著(P＜0.01)(圖2)。

圖 2 梅山豬在胚胎附植期不同組織中 EphB2蛋白表達變化 (GAPDH為內(nèi)參基因)柱形圖之間的*和**分別代表兩者間差異顯著水平為0.05(P＜0.05)和0.01(P＜0.01)。

EphB2在卵巢組織中的蛋白表達曲線則呈先降低后升高的趨勢，即在胚胎附植早期至中期的過程中表達量持續(xù)降低，在胚胎附植中期至晚期的過程中表達量持續(xù)升高。其中，妊娠第18 d的表達量最低，且顯著低于妊娠第13 d和第24 d的蛋白表達量(P＜0.05)。

2.3 EphB2差異表達分析

RNA-seq結(jié)果表明，EphB2在梅山豬胚胎附植前期(13 d)和中期(18 d)子宮內(nèi)膜附植點的mRNA表達量分別為1.59和6.43，且兩者差異極顯著(P ＜0.01)。在附植中期和后期卵巢組織中的 mRNA表達量分別為1.51和 0.73，且兩者差異顯著(P＜0.05)。RNA-seq的質(zhì)量評估結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序的大部分 Reads(較短的原始測序序列)重復(fù)性強，Reads堿基大多分布于低密度區(qū)域(圖3)。

3 討 論

豬胚胎附植過程的特點是附植前期特別長，即胚胎滋養(yǎng)層細胞侵入腔上皮細胞之前有充分的時間進行觀察，因此，可將豬作為研究胚胎附植前期調(diào)控機理的理想動物模型[14]。豬胚胎附植相關(guān)基因已有報道，如過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)[15]、黏液素1(Muc1)[16]、瘦素及其受體(Obesity gene and obesity gene long form receptor)[17]。EphB2基因?qū)儆谑荏w酪氨酸激酶基因(Receptor tyrosine kinase gene)[11]，屬于Eph-Ephrin家族系統(tǒng)中的一員，該系統(tǒng)功能與胚胎附植有著很緊密的聯(lián)系[18]。

圖3 轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)量評估結(jié)果A：Reads重復(fù)性評估(比對到相同基因組位置的 Reads 被認定為重復(fù) Reads)；B：Reads 堿基分布熱圖(藍色表示低密度區(qū)域，橘黃色表示中密度區(qū)域，紅色表示高密度區(qū)域)。

本研究采用qRT-PCR、Western blot和RNA-seq方法，在梅山豬胚胎附植前(妊娠第13 d)、中(妊娠第18 d)、后(妊娠第24 d)期均檢測到EphB2基因在豬子宮內(nèi)膜中和卵巢中的表達。qRT-PCR結(jié)果表明，Eph B2在豬子宮內(nèi)膜附植點和非附植點上的mRNA表達量從胚胎附植前期至后期呈先升高后降低的趨勢，且在附植中期表達量極顯著高于其他時期(P＜0.01)。另外，附植前、中、后期，EphB2在卵巢中的表達趨勢與子宮內(nèi)膜中的相反。這說明 EphB2很可能參與了豬胚胎附植過程中子宮內(nèi)膜和胚胎之間的遷移和粘附活動，這與其調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的粘附、生長和侵入的作用類似[10]。作為EphB2的配體，EphrinB2在6月齡蘇鐘豬子宮內(nèi)膜組織中的表達量顯著高于其他組織[19]。該家族成員EphrinA3在胚胎附植期的mRNA表達趨勢同EphB2一致[18]。

Western blot 結(jié)果表明，EphB2 mRNA翻譯的蛋白在胚胎附植期各組織中的表達趨勢同mRNA基本保持一致，即子宮內(nèi)膜附植點和非附植點蛋白表達量在胚胎附植前期到中期逐漸升高，中期到后期逐漸降低。卵巢表達趨勢則相反，為先降低后升高。這進一步說明 EphB2可能參與了豬胚胎附植的調(diào)控。EphA1、EphA2和EphA4基因[8]在豬胚胎附植期子宮內(nèi)膜附植點也表現(xiàn)先升高后降低的蛋白表達趨勢。另外，EphB2所在的 Eph-Ephrin系統(tǒng)在人[6]和小鼠[7]的胚胎附植過程中也發(fā)揮著重要作用。

通過轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)[20]，本研究在梅山豬胚胎附植期的子宮內(nèi)膜附植點和卵巢的差異表達基因中發(fā)現(xiàn)了EphB2，且不同附植期的mRNA表達差異顯著。結(jié)合qRT-PCR和Western blot結(jié)果，初步斷定EphB2在梅山豬的胚胎附植調(diào)控中很可能發(fā)揮著重要的作用。

綜上所述，EphB2基因作為Eph-Ephrin系統(tǒng)中的一個受體，在豬的胚胎附植中期mRNA和蛋白表達量都非常顯著，預(yù)示著其在豬胚胎附植活動中發(fā)揮著重要作用。

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(責任編委: 蔣思文)

Tissue expression of EphB2 and RNA-seq analysis during embryo implantation in Meishan pigs

Yanfeng Fu1, Yanhong Zhou1,2, Aiguo Wang3, Lan Li4,5, Honglin Liu2, Bixia Li1, Shouwen Ren1

1. The Key Laboratory of Animal Breed Improvement and Reproduction, Institute of Animal Science, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
2. College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

3. College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China;
4. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China;
5. National Research Center of Veterinary Biologicals Engineering and Technology, Nanjing 210014, China

Abstract:Embryo implantation is a key step affecting swine litter size, which is an important economic and reproduction trait in pigs. In order to investigate the effect of erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2) on endometrium migration and attachment during swine embryo implantation, the mRNA and protein expression levels of EphB2 in endometrium implantation sites, endometrium non-implantation sites and ovary were detected in Meishan sows during pre-implantation, mid-implantation and post-implantation period using real-time quantitative PCR and Western blot. Differential expression genes were also analyzed in endometrium implantation sites and ovary during different implantation periods by RNA sequencing (RNA-seq) technology. The qRT-PCR and Western blot results showed that EphB2 mRNA and protein expression curve was the same in endomtrium implantation sites and endometrium non-implantation sites during pre-implantation, mid-implantation and post-implantation period, with a first increase followed by a decrease, and its expression level during mid-implantation was significantly higher than pre-implantation and post-implantation (P＜0.01). In contrast, EphB2 mRNA and protein expression curve in ovary during pre-implantation, mid-implantation and post-implantation period showed a first decrease followed by an increase, and the expression levels were significantly different among different implantation periods (P＜0.05). RNA-seq results indicated that EphB2 mRNA expression during mid-implantation was higher than that of pre-implantation extremely significantly in endometrium implantation sites (P＜0.01), and was significantly higher than that of post-implantation in ovary (P＜0.05). By and large, EphB2 might play an important role in swine embryo implantation, and it’s a potential candidate gene for litter size in pigs.

EphB2; embryo implantation; expression; RNA-seq; Meishan pig

2014-03-22;

2014-06-11

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31201767)，江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(編號：CX(13)5042)，國家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-南京綜合試驗站項目(編號：nycytx-009)和江蘇省科技支撐計劃項目(編號：BE2012333)資助

付言峰，博士，副研究員，專業(yè)方向：動物遺傳育種與繁殖。Tel: 025-84391941，E-mail: fuyanfeng@jaas.ac.cn

周艷紅，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: 954268869@qq.com

付言峰和周艷紅同為第一作者。

任守文，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動物遺傳育種與生產(chǎn)。E-mail: shouwenren@163.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1243

時間: 2014-9-17 17:27:24

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140917.1727.005.html