潘學(xué)峰，姜楠，陳細(xì)芳，周曉宏，丁良，段斐

1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081；

2. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，保定 071002

R環(huán)的形成及對基因組穩(wěn)定性的影響

潘學(xué)峰1,2，姜楠1，陳細(xì)芳1，周曉宏1，丁良2，段斐2

1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081；

2. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，保定 071002

R-環(huán)是由一個RNA:DNA雜交體和一條單鏈狀態(tài)的DNA分子共同組成的三鏈核酸結(jié)構(gòu)。其中，RNA:DNA雜交體的形成起因于基因轉(zhuǎn)錄所合成的RNA分子不能與模板分開，或RNA分子重新與一段雙鏈DNA分子中的一條鏈雜交。在基因轉(zhuǎn)錄過程中，當(dāng)轉(zhuǎn)錄泡遇到富含 G堿基的非模板鏈區(qū)或位于某些與人類疾病有關(guān)的三核苷酸衛(wèi)星DNA時，轉(zhuǎn)錄泡后方累積的負(fù)超螺旋可促進(jìn)R環(huán)形成。同時，新生RNA分子未被及時加工、成熟或未被快速轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)等因素也會催生 R環(huán)。研究表明，細(xì)胞擁有多種管理R環(huán)的方法，可以有效地管理R環(huán)的形成和處理已經(jīng)形成的R環(huán)，以盡量避免R環(huán)對DNA復(fù)制、基因突變和同源重組產(chǎn)生不利影響。文章重點分析了R-環(huán)的形成機制及R環(huán)對DNA復(fù)制、基因突變和同源重組的影響，并針對R-環(huán)誘導(dǎo)的DNA復(fù)制在某些三核苷酸重復(fù)擴增有關(guān)的神經(jīng)肌肉退行性疾病發(fā)生過程中的作用進(jìn)行了分析和討論。

RNA:DNA雜交體；R-環(huán)；基因轉(zhuǎn)錄；DNA復(fù)制；基因組穩(wěn)定性

DNA復(fù)制是DNA聚合酶依半保留方式合成雙鏈DNA的過程，而基因轉(zhuǎn)錄則是RNA聚合酶利用雙鏈DNA中的一條鏈為模板合成RNA的過程?；蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA分子必須在轉(zhuǎn)錄泡后方與DNA模板分開，以容許兩條被打開呈單鏈的DNA分分重新恢復(fù)為雙鏈DNA。但是，發(fā)生在某些基因組位點處的基因轉(zhuǎn)錄所合成的 RNA分子難于與其模板DNA分開，或很容易重新與模板 DNA復(fù)性形成RNA:DNA雜交體。這種RNA:DNA雜交體與非模板鏈一起形成R環(huán)結(jié)構(gòu)。

研究發(fā)現(xiàn)，R環(huán)結(jié)構(gòu)會影響DNA復(fù)制叉的移動，引發(fā)基因組不穩(wěn)定[1～5]。為此，細(xì)胞將 RNA修飾、加工、運輸與轉(zhuǎn)錄延伸相互偶聯(lián)，以盡可能使新生RNA分子被高效加工或被及時輸送到細(xì)胞質(zhì)中，以降低RNA:DNA雜交體的形成機會。同時，細(xì)胞還擁有能特異切割R環(huán)中RNA分子的核酸酶和能夠打開RNA:DNA雜交體的解旋酶，清除已經(jīng)形成的R環(huán)。另外，大腸桿菌(Escherichia coli) ColE1質(zhì)粒的DNA復(fù)制、真核生物線粒體DNA的復(fù)制以及哺乳類動物免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換(Immunoglobulin (Ig) class switching)等分子過程則需要借助基因轉(zhuǎn)錄形成R環(huán)結(jié)構(gòu)之后才能進(jìn)行[6,7]。

1 與R環(huán)形成有關(guān)的要素及R環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性

基因轉(zhuǎn)錄可否形成R環(huán)與3個要素有關(guān)：(1)位于轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)的非模板鏈DNA含有較多的G堿基；(2)轉(zhuǎn)錄泡后方積累過量的負(fù)超螺旋(Supercoiling)；(3)在轉(zhuǎn)錄區(qū)附近存在DNA切口。

對細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，R環(huán)通常出現(xiàn)在富含G堿基的非模板鏈部位。當(dāng) G堿基在非模板鏈上呈簇(G-cluster) 分布時，可以啟動R環(huán)形成，而在這一起始位之后的一段富含G堿基區(qū)域則有助于R環(huán)成長。當(dāng)在大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄多聚GC或多聚GT序列時發(fā)現(xiàn)，非模板鏈上G豐裕是基因轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)R環(huán)的首要條件[8～11]。

正?；蜣D(zhuǎn)錄過程中，轉(zhuǎn)錄泡后方常會積累負(fù)超螺旋，這種負(fù)超螺旋可以使單鏈狀態(tài)的DNA重新恢復(fù)為雙鏈。在R環(huán)形成過程中，上述負(fù)超螺旋則促使RNA分子與模板DNA“退火”形成RNA:DNA雜交體(圖1)。除此之外，由于R環(huán)形成時需要RNA分子和模板DNA發(fā)生交互纏繞，因此，出現(xiàn)在啟動子下游的DNA缺口(DNA nick)也有助于R環(huán)的形成[12]。

利用基于上述序列特征研發(fā)的計算機軟件對已有66 803個基因DNA序列分析表明，多達(dá)59%的基因具有在基因轉(zhuǎn)錄中形成R環(huán)的能力。其中TP53、BRCA1、BRCA2、KRAS和PTPRD等屬于癌基因和抑癌基因，而ATM、PARK2、PTPRD和GLDC基因則與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病有關(guān)[13]。

一個R環(huán)的穩(wěn)定性取決于R環(huán)內(nèi)RNA分子的大小、DNA分子中脫氧嘧啶/脫氧嘌呤的比例，以及可能形成的A?T/U的數(shù)目[14]。一般而言，R環(huán)中的RNA分子越長，R環(huán)越穩(wěn)定；RNA與DNA分子所形成的氫鍵數(shù)目越多，R環(huán)越穩(wěn)定。而當(dāng)堿基數(shù)相同時，RNA:DNA雜交體比相同長度的雙鏈DNA更穩(wěn)定[15]。

R環(huán)可以在基因轉(zhuǎn)錄的延伸(生長)和終止兩個階段生成[16～18]。在真核細(xì)胞內(nèi)，hnRNA的5′端和3′端加工、內(nèi)含子拼接、新生mRNA分子組裝成mRNP復(fù)合體等任意環(huán)節(jié)出現(xiàn)“故障”，均會促使R環(huán)在轉(zhuǎn)錄的延伸階段形成[16,19,20](圖1)。

以社會主義核心價值觀為引領(lǐng)，是構(gòu)建高校德育工作的必然要求。首先，它凝練了社會主義科學(xué)發(fā)展的精神內(nèi)核；其次，它展示了建設(shè)中國特色社會主義理論成果與實踐成果的一體化；第三，明確了青年學(xué)生的精神追求，進(jìn)一步指明了高校德育工作的方向，明確了高校德育工作的目標(biāo)。

對酵母(Saccharomyces cerevisiae)的研究表明，RNA 轉(zhuǎn)錄延伸因子 Sub-Yra1、Thp1-Sac3和THO-TREX-2等[19～22]以及負(fù)責(zé) RNA向細(xì)胞質(zhì)運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)或與RNA更新(Turn-over)有關(guān)的降解酶體缺陷均能促進(jìn)R環(huán)的形成[19]。同樣，原核基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯偶聯(lián)等環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題也會促生RNA分子與轉(zhuǎn)錄模板DNA復(fù)性形成R環(huán)[17,18]。利用雙環(huán)霉素抑制大腸桿菌細(xì)胞中Rho因子的RNA解旋酶活性，發(fā)現(xiàn)在依賴Rho因子終止的許多基因轉(zhuǎn)錄終止區(qū)出現(xiàn)R環(huán)[23]；而滅活酵母細(xì)胞內(nèi)的Sen1(RNA解旋酶通常與Rat1蛋白一起協(xié)助轉(zhuǎn)錄終止)[24,25]，或缺失人類細(xì)胞內(nèi)的Senataxin (SETX)(與酵母Sen1功能相同)也會在許多轉(zhuǎn)錄終止信號 poly(A)的下游出現(xiàn)R環(huán)[22,26,27]。

圖1 RNA:DNA雜交體(R環(huán))的形成基因轉(zhuǎn)錄過程中由于轉(zhuǎn)錄泡積累的超螺旋扭力或RNA加工延遲促使新生mRNA在伸出RNAP復(fù)合體之后重新與DNA模板鏈形成氫鍵，形成RNA:DNA雜交體(R loop)。

2 細(xì)胞對R環(huán)的監(jiān)管

R環(huán)除干擾基因的轉(zhuǎn)錄之外，也會影響DNA復(fù)制。為此，細(xì)胞通過使用特異的核酸酶切除R環(huán)，利用拓?fù)洚悩?gòu)酶調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄泡后方負(fù)超螺旋數(shù)量，或利用轉(zhuǎn)錄延伸因子提高轉(zhuǎn)錄延伸效率，或及時向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移新生的RNA分子等手段降低RNA與模板DNA的雜交機會，以及通過使用RNA/DNA解旋酶打開R環(huán)中的RNA:DNA雜交體等手段監(jiān)控和管理R環(huán)的形成[2,3,18]。例如，大腸桿菌細(xì)胞擁有可特異水解RNA:DNA雜交體分子中RNA的核酸酶RNase HA和 B，它們分別以單體和異源三聚體的形式發(fā)揮作用。這些RNAase與用于處理“廢棄”mRNA分子的RNase E家族具有高度同源性。同樣，真核生物細(xì)胞中也擁有其同工酶 RNaseH1、RNaseH2A、RNaseH2B、RNaseH2C和EVRK6等。與大腸桿菌RNase HA和HB相似，它們均能特異地降解R環(huán)中的 RNA 分子[2,3,28～30]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，Aicardi-Goutières綜合征即起因于患者細(xì)胞內(nèi)的 RNase H2的功能缺陷。此外，普遍存在于原核和真核細(xì)胞內(nèi)的Top1 (Topoisomerase 1或topA)也會通過影響轉(zhuǎn)錄泡后方負(fù)超螺旋的累積而降低R環(huán)的形成幾率[31,32]。此外，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)還存在著一種依賴ATP的蛋白質(zhì)Cas3，可以在ATP缺乏時促進(jìn)R環(huán)的形成，而在ATP充裕時解除已經(jīng)形成的R環(huán)。這一現(xiàn)象暗示，R環(huán)的形成可能是一個受調(diào)節(jié)的過程[33]。

此外，大腸桿菌細(xì)胞中的 RecG解旋酶、Rho RNA解旋酶則可以分別針對轉(zhuǎn)錄延伸和終止階段的RNA:DNA雜交體發(fā)揮作用[5,6,23]。同樣，真核細(xì)胞中RecG 的同工酶 Pif1[34]、DHX9 (RHA)[35]和 SAPK (Hog1)[36]，以及Rho因子的同工酶Sen1/Senataxin[24,25]均可以在基因轉(zhuǎn)錄的延伸和終止階段規(guī)避或清除RNA:DNA雜交體(表1)。

由于上述蛋白中的一些成員可以協(xié)助 DNA復(fù)制叉“跨越”RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)，可以對基因轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制加以協(xié)調(diào)，因此，它們又被稱為“轉(zhuǎn)錄-復(fù)制介導(dǎo)者”(Transcription replication mediator) (表1)。大腸桿菌的RecG既能清除RNA:DNA雜交體，也能參與DNA復(fù)制叉回轉(zhuǎn)；酵母Sen1也能避免DNA復(fù)制叉和轉(zhuǎn)錄單位間發(fā)生“碰撞”，降低 RNA: DNA雜交體和異常的DNA結(jié)構(gòu)的形成機會[36～38]。在上述過程中，Sen1通常與 RNA結(jié)合蛋白 Nrd1和Nab3形成復(fù)合體共同參與 RNA聚合酶 II催化的mRNA轉(zhuǎn)錄終止。該復(fù)合體主要負(fù)責(zé)缺乏Poly(A)(多聚腺嘌呤)信號的基因轉(zhuǎn)錄的終止，包括小分子核內(nèi)RNA(small nuclear (snRNA)、小分子核仁RNA(small nucleolar (snoRNA)[26]、隱性不穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物(cryptic unstable transcripts)[27]，以及某些異常mRNA的轉(zhuǎn)錄終止等[37]。研究表明，人體中Senataxin缺陷是誘發(fā)Ⅱ型精神性視覺失明共濟失調(diào)(Ataxia-ocular apraxia type 2，AOA2)[39]和Ⅳ型肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis type 4，ALS4)[40]等嚴(yán)重神經(jīng)退行性疾病的主因。

表1 影響基因轉(zhuǎn)錄過程中RNA:DNA雜交體形成的蛋白因子或解旋酶

3 基因轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制之間的相互影響

原核細(xì)胞 DNA復(fù)制速率和基因轉(zhuǎn)錄速率相差較大，分別為600～730核苷酸/秒和50核苷酸/秒。因此，原核細(xì)胞中同時進(jìn)行的DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄有可能會彼此“沖突”，表現(xiàn)為DNA復(fù)制器和RNA聚合酶之間延相反方向運動時的相撞或延相同方向運動時的追尾。與此不同，真核細(xì)胞中的DNA復(fù)制速率和基因轉(zhuǎn)錄速率比較接近，分別為17～33核苷酸/秒和大約17～72核苷酸/秒，因此，通常較少出現(xiàn)DNA復(fù)制器和RNA聚合酶之間的相撞或追尾。然而，在某些特定生理條件下，真核細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄模式會發(fā)生改變，使DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄之間發(fā)生相撞或追尾的機會大大增高[1,3,4,36,41]。DNA 復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄之間的相互沖突以兩種形式出現(xiàn)：一是基因轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的拓?fù)鋵W(xué)扭力干擾DNA復(fù)制；二是基因轉(zhuǎn)錄過程中形成R環(huán)，并借此影響DNA復(fù)制。一般認(rèn)為，基因轉(zhuǎn)錄引發(fā)的拓?fù)鋵W(xué)扭力對DNA復(fù)制的影響會更多地出現(xiàn)在兩者相向運動之時。此時，RNA轉(zhuǎn)錄泡前方和DNA復(fù)制叉前方積累的正超螺旋扭力(Topological constraint)會同時減緩基因轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制叉的移動速度。對大腸桿菌和酵母的研究表明，當(dāng)DNA復(fù)制叉和轉(zhuǎn)錄泡相向相遇時，盡管DNA復(fù)制叉的移動速率減緩，但它卻可以強力進(jìn)入轉(zhuǎn)錄中的DNA區(qū)域，并被迫停止于該區(qū)域。此時，復(fù)制叉前方積累的過量的正超螺旋迫使 DNA復(fù)制叉內(nèi)的前導(dǎo)鏈和后隨鏈上的新生 DNA鏈相互復(fù)性形成“雞爪”(Chicken-foot)結(jié)構(gòu)(圖2)[42]。

基因轉(zhuǎn)錄形成的R環(huán)可直接阻擋復(fù)制叉的運動。研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著R環(huán)形成，RNA聚合酶通常會被“陷”在轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)。因此，在阻擋DNA復(fù)制叉移動時，R環(huán)和RNA聚合酶可能共同發(fā)揮了作用。例如，當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在含有紫外線損傷的 DNA區(qū)段時，RNA聚合酶就會被“陷”在轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)。在此情況下，RNA聚合酶直接參與了阻擋DNA復(fù)制叉地移動。除此之外，當(dāng)R環(huán)中非模板單鏈DNA上發(fā)生損傷，如含有DNA加合物(DNA adduct)，或折疊出了某些類型的非B型DNA二級結(jié)構(gòu)，也會增加R環(huán)對DNA復(fù)制叉的阻擋力度[43]。

在某些生理逆境下，RNA聚合酶被陷在轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)可能是一種代表性的事件。為此，細(xì)胞采取合成“(p)ppGpp”分子(ppGpp是針對逆境生長產(chǎn)生的一種嚴(yán)謹(jǐn)型反應(yīng)調(diào)控因子)以降低“開放型”RNA聚合酶復(fù)合體(延伸階段中的RNA聚合酶與DNA模板結(jié)合狀態(tài))與 DNA模板的結(jié)合強度，釋放被“陷住”的RNA聚合酶，并同時放行被阻擋的DNA復(fù)制叉[44]。同時，GreA[17,45]、GreB[17]和DksA[46]，以及Mfd(轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的修復(fù)因子)等具有幫助解除“陷”在DNA損傷部位的RNA聚合酶復(fù)合體的功能[47]。

4 R環(huán)與基因組的穩(wěn)定

R環(huán)結(jié)構(gòu)可以因其對DNA復(fù)制叉的阻擋衍生出一系列的DNA次級損傷，如DNA復(fù)制叉崩潰、復(fù)制叉逆轉(zhuǎn)、DNA雙鏈斷裂(DSBs)和單鏈DNA空缺(ssDNA gap)等[48～50](圖3)。這些類型的DNA損傷大多數(shù)需要啟用包括同源重組在內(nèi)的修復(fù)機制加以修復(fù)，以盡可能降低基因轉(zhuǎn)錄所引發(fā)的基因突變和基因的高頻重組[51～56]。

4.1 基因轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)的高頻重組

諸多研究表明，處于高頻轉(zhuǎn)錄或位于R環(huán)中的非模板DNA單鏈非常容易受到損傷，包括DNA雙鏈斷裂或單鏈DNA斷裂等。此時，細(xì)胞內(nèi)的同源重組(HR)修復(fù)會被啟動(圖3)。

圖2 超螺旋扭力對DNA復(fù)制叉和R環(huán)形成的影響A：DNA復(fù)制叉和轉(zhuǎn)錄泡移動方向。兩者相向移動時，復(fù)制叉和轉(zhuǎn)錄泡前方積累的正超螺旋可同時降低DNA聚合酶的前進(jìn)速度；B：正超螺旋增加DNA復(fù)制叉內(nèi)新合成的兩條DNA鏈逆轉(zhuǎn)(fork reversal)的幾率；而轉(zhuǎn)錄泡后方累積的負(fù)超螺旋除把 DNA單鏈恢復(fù)為雙鏈的同時也促進(jìn)RNA:DNA雜交。

圖3 R環(huán)對DNA復(fù)制及基因組穩(wěn)定性的可能影響以DNA復(fù)制叉和轉(zhuǎn)錄泡同向移動為例，DNA復(fù)制叉跨過R環(huán)時，分別造成DNA前導(dǎo)鏈和后隨鏈的DNA復(fù)制的停止，此時，后續(xù)DNA復(fù)制取決于R環(huán)內(nèi)RNA分子是否被成功修復(fù)，如果R環(huán)被成功修復(fù)，則DNA復(fù)制可以繼續(xù)，否則誘發(fā)復(fù)制叉內(nèi)的DNA重排。

同源重組主要用于修復(fù) DNA的雙鏈斷裂和單鏈空缺，分別在真核細(xì)胞S/G2時相和原核細(xì)胞DNA復(fù)制過程中發(fā)揮作用。研究表明，基因轉(zhuǎn)錄所促生的 R環(huán)可以激發(fā)同源重組。對裂殖酵母(S. pombe)和出芽酵母(S. cerevisiae)的研究發(fā)現(xiàn)，這類與基因轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)的同源重組(Transcription associated recombination，TAR)往往伴隨著 RNA聚合酶 I和 II催化的基因轉(zhuǎn)錄過程，而且大多出現(xiàn)在DNA復(fù)制過程中。顯然，它們與基因轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制之間的“沖突”有關(guān)。酵母的THO缺陷株和大腸桿菌DksA突變株可以明確印證這一現(xiàn)象[46,51,52]。在酵母細(xì)胞內(nèi)，THO是由Tho2、Hpr1、Mft1和Thp2蛋白組成的復(fù)合體，主要負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄的延伸。當(dāng)人為造成該復(fù)合體功能缺陷時，酵母細(xì)胞內(nèi)可高頻出現(xiàn)R環(huán)結(jié)構(gòu)，使基因轉(zhuǎn)錄延伸效率降低，并伴隨高頻的同源重組[50]。同樣，缺失 DksA的大腸桿菌細(xì)胞中也會造成基因轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制之間的“沖突”，并誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答和RecA依賴的同源重組反應(yīng)[46]。

因此，TAR出現(xiàn)的根本原因與基因轉(zhuǎn)錄形成R環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)。一種可能是R環(huán)結(jié)構(gòu)中的單鏈DNA(非模板鏈)會更容易與同源重組蛋白識別和作用(圖3)，或R環(huán)的形成造成了DNA雙鏈斷裂[50,57]。

與其他類型的同源重組不同，大多數(shù)的TAR頻繁地出現(xiàn)在只含有一個斷端的雙鏈DNA斷裂處，表明TAR可能更傾向于發(fā)生在被停滯的DNA復(fù)制叉部位[57]。

TAR的出現(xiàn)可能是細(xì)胞試圖避免基因轉(zhuǎn)錄所引發(fā)的遺傳不穩(wěn)定性。在基因組的不穩(wěn)定性方面，TAR究竟如何發(fā)揮作用目前尚不清楚。但可以肯定的是，TAR的發(fā)生有可能會避免基因轉(zhuǎn)錄對 DNA復(fù)制的干擾。因此，TAR現(xiàn)象可能是原核和真核生物中普遍存在的一種DNA維護(hù)機制，但對基因組的穩(wěn)定性維護(hù)卻表現(xiàn)出雙重調(diào)節(jié)作用[57～59]。

4.2 基因轉(zhuǎn)錄引發(fā)基因突變

基因轉(zhuǎn)錄除提高TAR的同時，還能增高相關(guān)基因的突變率——轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)的基因突變(Transcriptionassociated mutation，TAM)。與TAR一樣，TAM幾乎存在于所有物種的基因轉(zhuǎn)錄過程中。

TAM可能與單鏈DNA損傷有關(guān)。通常情況下，位于正?；蜣D(zhuǎn)錄泡內(nèi)的非模板 DNA單鏈壽命短暫，會被負(fù)超螺旋重新恢復(fù)成雙鏈。因此，發(fā)生損傷的機會很少。但在持續(xù)或高強度基因轉(zhuǎn)錄過程中，或者基因轉(zhuǎn)錄促生了R環(huán)，那么非模板DNA呈單鏈時間會被顯著增長。此時的單鏈DNA變得更容易受損，并相應(yīng)提高所在基因的突變率。本實驗室的研究結(jié)果也表明，缺失 RecG的大腸桿菌細(xì)胞會因持續(xù)的基因轉(zhuǎn)錄而使基因 LacI的突變率大大提高(未發(fā)表)。

研究表明，脫氨基反應(yīng)會選擇性地發(fā)生在轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)的非模板DNA單鏈上。脫氨基反應(yīng)可以使胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)換為尿嘧啶。這種脫氨基反應(yīng)出現(xiàn)在單鏈DNA上的幾率要比出現(xiàn)在雙鏈高出140倍以上[60]。同樣，基因毒性物質(zhì) 4-硝基喹啉-1-氧化物或甲基-甲烷化物也會選擇性地攻擊基因轉(zhuǎn)錄泡中的非模板鏈，并使重組效率增加4000倍之多[53]。Gómez-González等[61]在人類B細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種針對非轉(zhuǎn)錄模板鏈上胞嘧啶脫氨基的激活誘導(dǎo)的胞嘧啶脫氨酶(Activation-induced cytidine deaminase-AID)，該酶可以特異性增加非模板鏈胞嘧啶脫氨基反應(yīng)的頻率，并在很大程度上提高了非模板鏈的基因突變率。同時，有證據(jù)表明AID參與R環(huán)引發(fā)的DNA雙鏈斷裂反應(yīng)過程。例如，常見于B淋巴細(xì)胞內(nèi)的原癌基因BCL6、RhoH、PIM1和PAX5中出現(xiàn)的易位基因突變往往會發(fā)生在富含G堿基的DNA序列位點，這些位點都是R 環(huán)形成的偏好部位。與上述位點基因突變有關(guān)的人類疾病過程中出現(xiàn)的DNA雙鏈斷裂的產(chǎn)生均與AID有關(guān)[62]。

5 R環(huán)與三核苷酸擴增關(guān)聯(lián)的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)退行性病變

脊髓-小腦共濟失調(diào)綜合征(SCA)、亨廷頓疾病、佛立德立希綜合征、肌營養(yǎng)不良和脆性X染色體綜合征等近40種人類神經(jīng)-肌肉系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生與三核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星 DNA CAG·CTG、GAA·TTC及CGG·CCG的擴增性和不穩(wěn)定性有關(guān)。多年的研究積累表明，上述三核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星DNA在轉(zhuǎn)錄時會形成R環(huán)[63～65]。例如,當(dāng)在體外分別轉(zhuǎn)錄CTG、CGG、CAG、CCG、GAA和TTC時會在重復(fù)序列內(nèi)形成R環(huán)(圖5)[64]。Lin等[65]的研究發(fā)現(xiàn)，R環(huán)結(jié)構(gòu)形成和CTG?CAG重復(fù)序列的不穩(wěn)定性具有相關(guān)性。當(dāng)轉(zhuǎn)錄富含GC堿基的DNA模板鏈會和新生 RNA鏈復(fù)性形成抗 RNase A而對RNase H敏感的穩(wěn)定R環(huán)[65]。當(dāng)RNase H1活性降低或敲除RNase H1和RNase H2時，轉(zhuǎn)錄依賴的CTG?CAG 重復(fù)序列的不穩(wěn)定性就會增加[65]。McIvor等[63]研究表明，在大腸桿菌和人類細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄GAA?TTC及CTG?CAG重復(fù)序列時可被誘導(dǎo)形成R環(huán)，并促進(jìn)重復(fù)序列本身的不穩(wěn)定，導(dǎo)致擴增或縮減。

當(dāng)前，尚欠缺關(guān)于RNA:DNA雜交體介導(dǎo)三核苷酸重復(fù)序列擴增不穩(wěn)定的分子解釋。為此，本課題組基于自己的研究發(fā)現(xiàn)，提出了RNA:DNA雜交體內(nèi)RNA分子誘發(fā)DNA復(fù)制的觀點(圖4)[66]。我們認(rèn)為，三核苷酸重復(fù)序列在轉(zhuǎn)錄過程中形成R環(huán)，其中的單鏈DNA(非模板鏈)發(fā)生斷裂(圖4，T0)，之后由RNA引導(dǎo)的DNA復(fù)制產(chǎn)生與轉(zhuǎn)錄非模板鏈相同的單鏈三核苷酸重復(fù)序列，該序列與斷裂的非模板鏈連接形成單鏈DNA空缺(圖4，T3-6)，隨后單鏈DNA空缺經(jīng)后續(xù)DNA復(fù)制填充，導(dǎo)致三核苷酸重復(fù)序列雙鏈的不穩(wěn)定性擴增[66]。

圖4 R環(huán)引發(fā)的三核苷酸重復(fù)序列微衛(wèi)星DNA的擴增機制

同時，來自其他實驗室的工作也表明，與上述疾病關(guān)聯(lián)的三核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列易在 DNA復(fù)制叉的后隨鏈模板和基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生錯誤折疊，形成非B型二級結(jié)構(gòu)。這些非B型DNA結(jié)構(gòu)也會影響DNA復(fù)制或基因轉(zhuǎn)錄[43,67,68]。

事實上，在三核苷酸重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄過程中，無論是模板鏈還是非模板鏈上形成包括發(fā)卡在內(nèi)的非B型DNA結(jié)構(gòu)都有可能干擾RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄[67]。對小鼠和人類細(xì)胞系的研究表明，識別錯配堿基的MSH2/MSH3復(fù)合體均能與CAG和CTG重復(fù)序列形成的 DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)內(nèi)的錯配對堿基結(jié)合[68]，并因此增加轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)的重復(fù)序列的不穩(wěn)定性[67,68]。MSH2/ MSH3復(fù)合體能與致病三核苷酸重復(fù)序列形成的鏈內(nèi)堿基錯配對、“鼓包”(Bulge)或DNA環(huán)(loop)結(jié)合，形成 DNA-蛋白復(fù)合體。這些都可能成為基因轉(zhuǎn)錄中的“路障”，導(dǎo)致RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的終止[43]。

6 R環(huán)與基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)控制

在特定生理條件下，基因組內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄形成的R環(huán)結(jié)構(gòu)可能參與某些基因的表觀遺傳控制。在人類基因組中，這類R環(huán)通常出現(xiàn)在未被甲基化修飾的CpG島的下游啟動子和5′非翻譯區(qū)之間富含G堿基的區(qū)域[69,70]。此時，R環(huán)結(jié)構(gòu)中的單鏈DNA可能起著招募或保護(hù)某些與基因表觀遺傳修飾直接有關(guān)的蛋白因子的作用。研究表明，這種修飾有助于維持組蛋白H3K4的三價甲基化狀態(tài)(與基因轉(zhuǎn)錄的活性有關(guān))或使DNA處于去甲基化狀態(tài)(需要DNA去甲基化蛋白復(fù)合體的催化)[69,70]。

7 結(jié)語與展望

眾所周知，出現(xiàn)在細(xì)胞周期S時相的基因轉(zhuǎn)錄會潛在影響DNA復(fù)制，引發(fā)轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制間的“沖突”。為了避免這類沖突的發(fā)生，基因組在進(jìn)化歷程中選擇性地把“轉(zhuǎn)錄”與“DNA復(fù)制”進(jìn)行“同向”組織，以盡可能避免沖突。即便如此，基因轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制之間發(fā)生“碰撞”或“追尾”的可能性依然不容忽視，尤其當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄促成R環(huán)之后，R環(huán)對DNA的復(fù)制干擾更加劇了問題的嚴(yán)重性。為此，生物采取利用轉(zhuǎn)錄-復(fù)制介導(dǎo)因子提高基因轉(zhuǎn)錄延伸和終止效率；利用高保守的RNaseH和RNA/DNA解旋酶等手段清除RNA:DNA雜交體。當(dāng)前，圍繞R環(huán)形成的分子過程及可能引發(fā)的基因組穩(wěn)定性問題已經(jīng)引起研究者的關(guān)注。圍繞這一基本生物學(xué)問題的研究產(chǎn)出可以更好地理解基因轉(zhuǎn)錄誘發(fā)的基因突變和基因高頻重組的生物學(xué)意義、某些三核苷酸重復(fù)序列在基因轉(zhuǎn)錄過程中形成R環(huán)所能發(fā)揮的病理學(xué)貢獻(xiàn)，及基因轉(zhuǎn)錄在基因組進(jìn)化進(jìn)程中的作用。

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(責(zé)任編委: 楊中州)

R-loop structure: the formation and the effects on genomic stability

Xuefeng Pan1,2, Nan Jiang1, Xifang Chen1, Xiaohong Zhou1, Liang Ding2, Fei Duan2

1. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;
2. School of Basic Medicine, Hebei University, Baoding 071002, China

R-loop is a type of three-stranded nucleic acid structure that is made up of an RNA:DNA hybrid, formed due to failing separation of a nascent RNA molecule with transcripting template in transcription or by the re-annealing of RNA molecule with one of the two strands in a double stranded DNA molecule, along with the single stranded DNA, which is either the non-template strand in the transcription bubble or the RNA substituted DNA strand. Formation of R-loops can occur when transcription goes through a genomic DNA region having a tract of G bases in the non-template strand in the transcription bubble or through a type of triplet microsatellite DNA sequences that are known to be associated with certain human diseases. The negative supercoiling forces accumulated in the transcription bubble, and the misprocessing of RNA precursors, as well as the delayed utilizations and transportations of RNA molecules to cytoplasm promote R loop formation. Many studies show that cells can manage R loop formation with efficiency, and can also process the R-loops already formed in the cell, and by which, the bad effects of R-loops on DNA replication, gene mutation and homologous recombination can be regulated. In this review,we summarize theformation and the impacts of R-loops on DNA replication, mutation rates and the frequencies of homologous recombination, and also discusse the possible role of the R-loop induced DNA replication in mediating trinucleotide repeat expansions as seen with those frequently associated with human neuromuscular degenerative diseases.

RNA:DNA hybrid; R-loop; gene transcription; DNA replication; genome stability

2014-04-01;

2014-06-05

北京理工大學(xué)自然科學(xué)基礎(chǔ)基金項目(編號：3160012211215)和北京市自然科學(xué)基金項目(編號：5132014)資助

潘學(xué)峰，博士，教授，研究方向：分子遺傳學(xué)。E-mail: xuefengpancam@aliyun.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1185

時間: 2014-10-16 16:06:06

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141016.1606.005.html