唐 何毛誼平林 海* 李子君任榮軍

（1 湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院,湖南 長(zhǎng)沙 410000；2 岳陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所,湖南 岳陽(yáng) 414000；3 湖南省中藥不良成分快速檢測(cè)及脫除工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙 410208）

HPLC法測(cè)定骨傷愈合膠囊中三七皂苷R1的含量

唐 何1毛誼平2林 海1* 李子君2任榮軍2

（1 湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院,湖南 長(zhǎng)沙 410000；2 岳陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所,湖南 岳陽(yáng) 414000；3 湖南省中藥不良成分快速檢測(cè)及脫除工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的建立HPLC法測(cè)定骨傷愈合膠囊中三七皂苷R1含量。方法色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫為30 ℃。結(jié)果三七皂苷R1在0.2048～2.0480 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9999（n=5），平均回收率為99.0%（n=9），RSD為0.8%。結(jié)論該方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，能簡(jiǎn)便有效控制骨傷愈合膠囊中三七皂苷R1的含量。

高效液相色譜；骨傷愈合膠囊；三七皂苷R1

骨傷愈合膠囊為湖南省汨羅市中醫(yī)院醫(yī)院制劑,處方是多位骨科專家十多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方,由三七、當(dāng)歸、紅花、大黃、乳香、沒(méi)藥六味中藥組成,具有活血化瘀、消腫止痛的作用,用于跌打損傷,傷筋動(dòng)骨,瘀血腫痛等癥[1]。目前該藥已治療各種跌打損傷及骨折近5000余病例,效果顯著,尚無(wú)一例不良反應(yīng),確實(shí)為治療跌打損傷和骨折的理想藥物。三七具有“止血,散血,定痛”的功效,為本方君藥。而目前尚未見(jiàn)對(duì)骨傷愈合膠囊中三七成分進(jìn)行定量控制的報(bào)道,為有效保證本產(chǎn)品質(zhì)量,本試驗(yàn)選取三七中有效成分三七皂苷R1為指標(biāo)成分,采用HPLC法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定,該方法簡(jiǎn)便,能有效控制骨傷愈合膠囊中三七皂苷R1的含量,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器:Waters 2695/2489高效液相色譜儀；電子分析天平（梅特勒公司）；超聲波清洗機(jī)（濟(jì)寧奧波超聲電氣有限公司）。

1.2 試藥:三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào):110745-200617,供含量測(cè)定用,中國(guó)食品藥品檢定研究院）；骨傷愈合膠囊（批號(hào)為20121017、20121126、20121225,規(guī)格:0.4克/粒）；乙腈為色譜純,水為純凈水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件:Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流動(dòng)相:乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～12 min,81%～81% B；12～25 min,81%～70%B；25～28 min, 70%～81%B）,流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm,柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

①對(duì)照品溶液制備:精密稱取三七皂苷R1對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 mL含0.1024 mg的溶液,即得。②供試品溶液制備:取裝量差異項(xiàng)下本品內(nèi)容物,研細(xì),取約2.7 g,精密稱定,置錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,80 ℃水浴回流15 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)失重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。③陰性樣品溶液制備:按處方中藥味比例,制備不含三七的陰性樣品,按上述供試品溶液的制備方法制陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取供試品溶液、對(duì)照品溶液與陰性樣品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果表明供試品溶液與對(duì)照品溶液在約17 min處有相對(duì)應(yīng)的色譜峰,陰性樣品無(wú)干擾,理論塔板數(shù)以三七皂苷R1計(jì)＞4000,分離度＞1.5。見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μL注入液相色譜儀測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得回歸方程為Y=5.77×106x＋868.12,R=0.9999。表明三七皂苷R1在0.2048～2.048 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（批號(hào):20121017）10 μL,連續(xù)進(jìn)樣5次測(cè)定,其三七皂苷R1峰面積RSD為0.5%,表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào):20121017）,分別于0、2、4、8、12、24 h,精密吸取10 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定,結(jié)果峰面積RSD為1.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

圖1 A對(duì)照品、B供試品、C陰性樣品（三七皂苷R1）

取同一批號(hào)（20121017）樣品6份,按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,得三七皂苷R1平均含量為0.42毫克/粒,RSD為0.6%（n=6）,表明方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批號(hào)（20121017）骨傷愈合膠囊樣品（0.42毫克/粒）約0.4 g,精密稱定,分別精密加入三七皂苷R1對(duì)照品溶液4 mL,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果表明方法回收率良好,見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)表

2.9 樣品測(cè)定

精密量取供試品溶液及三七皂苷R1對(duì)照品溶液（0.1024mg/mL）各10 μL,注入高效液相色譜儀,按外標(biāo)法計(jì)算三七皂苷R1的含量。樣品中三七皂苷R1含量測(cè)定結(jié)果為:批號(hào)20121017含量為0.42毫克/粒,批號(hào)20121126含量為0.44毫克/粒,批號(hào)20121225含量為0.40毫克/粒。

3 討 論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。取三七皂苷R1對(duì)照品甲醇溶液,在190～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描,結(jié)果表明三七皂苷R1在波長(zhǎng)195 nm左右處有最大吸收,考慮溶劑的影響,在參考文獻(xiàn)[2-3]的基礎(chǔ)上,選擇203 nm作為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[4-6],考察了多種流動(dòng)相,如:乙腈-水溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液、乙腈-甲醇-水溶液,通過(guò)觀察比較色譜峰峰形、理論塔板數(shù)及峰拖尾因子,認(rèn)為乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脫,系統(tǒng)峰形較好,理論塔板數(shù)高,分離度達(dá)到要求,故選擇其為該色譜分析條件。

3.3 本制劑屬純中藥復(fù)方制劑。本試驗(yàn)對(duì)處方中三七皂苷R1進(jìn)行HPLC測(cè)定研究,該方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng),能簡(jiǎn)便有效控制骨傷愈合膠囊中三七皂苷R1的含量,取得了較好的效果,從而進(jìn)一步完善了骨傷愈合膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 向海洋.骨傷愈合膠囊定性定量研究[J].中南藥學(xué),2010,8(4):289-292.

[2] 謝耀軒,林亞珠.超高效液相色譜法測(cè)定三七中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2011,27(5):489-492.

[3] 俞堅(jiān),劉杭,王京霞.高效液相色譜法測(cè)定三七片中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008,26(2):421-422.

[4] 楊雪梅,劉旭,劉艷山,等.高效液相色譜法測(cè)定三七中三七皂苷R1及人參皂苷Rg1,Rb1的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2005,16(8):710-711.

[5] 孫巍,任斯文.高效液相色譜法測(cè)定利節(jié)散中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥雜志,2008,6(12):1-4.

[6] 李性天,周密妹,耿立堅(jiān),等.高效液相色譜法梯度法測(cè)定三七中三七皂苷R1含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2000,20(12):728-729.

Determination of Notoginsenoside R1 in Gushang Yuhe Capsules by HPLC

TANG He1, MAO Yi-ping2, LIN Hai1*, LI Zi-jun2, REN Rong-jun2
(1 Hunan Institute Food and Drug Control, Changsha 414000, China; 2 Yueyang Institute Food and Drug Control, Yueyang 414000, China; 3 Hunan Research Center of Engineering Technology for Rapid Test and Removal of Toxic and Harmful Substances in Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for determination the content of Notoginsenoside R1 in Gushang Yuhe Capsules. Methods The column was Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)and the temperature was 30 ℃;The mobile phase was acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution with linear gradient elution, detection was done at 203nm and a flow rate of 1.0 mL/min.ResultsNotoginsenoside R1 has a good linear relationships in 0.2048～2.048 μg(r=0.9999);the average recovery was 98.97%(n=9,RSD was 0.8%.ConclusionThe methods are sensitive, accurate and specific,which can be used for the quality control of Gushang Yuhe Capsules.

HPLC; Gushang Yuhe Capsules; Notoginsenoside R1

R282

B

1671-8194（2014）25-0006-02

2013年湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013SK5072）