趙雅寧，劉文倩，曹書華，郭霞，王紅陽

葡萄籽原花青素對睡眠呼吸暫停低氧大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)及認知功能的影響①

趙雅寧1,2,3，劉文倩2，曹書華3，郭霞2，王紅陽2

目的 探討葡萄籽原花青素(GSPE)對睡眠呼吸暫停低氧大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)及認知功能的影響。方法80只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分成對照組，模型組，GSPE高、低劑量組。對照組暴露于空氣中，模型組每天暴露于低氧條件下(50 ml/ L)8 h，持續(xù)時間2周和6周，GSPE高、低劑量組入艙前2周開始每天分別灌胃給藥GSPE 200 mg/kg、100 mg/kg。電鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)，比色法檢測大腦組織丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)水平，TUNEL法檢測凋亡細胞，水迷宮測試動物學(xué)習(xí)記憶功能。結(jié)果模型組海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)損傷，MDA含量顯著升高、SOD活性顯著降低、TUNEL陽性細胞顯著增多，水迷宮檢測動物逃避潛伏期時間顯著延長、穿臺次數(shù)顯著減少(P＜0.001)；與模型組比較，GSPE各組海馬區(qū)損傷減輕，MDA含量降低，SOD活性提高，TUNEL陽性細胞減少，水迷宮測試逃避潛伏期時間縮短、穿臺次數(shù)增多(P＜0.05)；高劑量組優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)。結(jié)論葡萄籽原花青素減輕睡眠呼吸暫停模式低氧大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)的損傷，改善認知功能。

睡眠呼吸暫停；學(xué)習(xí)；記憶；海馬；丙二醛；超氧化物歧化酶；凋亡；大鼠

[本文著錄格式]趙雅寧，劉文倩，曹書華，等.葡萄籽原花青素對睡眠呼吸暫停低氧大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)及認知功能的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2014,20(3):236-239.

阻塞性睡眠呼吸暫停患者睡眠時反復(fù)出現(xiàn)低氧血癥和/或高碳酸血癥，可造成大腦皮質(zhì)灰質(zhì)丟失，海馬區(qū)實質(zhì)萎縮等，出現(xiàn)認知障礙[1]。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)是從葡萄籽中提取的生物黃酮物質(zhì)。研究表明，GSPE具有極強的抗氧化和清除自由基作用，且具有調(diào)節(jié)血脂、降低血糖、穩(wěn)定血壓、保護心腦血管、抗腫瘤等作用[2-5]。本研究模擬臨床呼吸暫停事件，建立睡眠呼吸暫停間歇性低氧大鼠模型，探討葡萄籽原花青素對睡眠呼吸暫停低氧大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)的損傷及認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性Sprague-Dawley大鼠80只：北京維通利華公司，合格證號SCXK(京)2002-003，體重310～350 g。TUNEL試劑盒：北京中杉生物有限公司。H-7650透射電鏡：日本日立公司。脂質(zhì)氧化物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒：南京建成科技公司。測氧儀：建德市梅城電化分析儀器廠。低氧控制程序：天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸科。純氮：天津六方氣體高科技有限公司。低氧艙：天津醫(yī)科大學(xué)研制。

1.2 動物分組和模型制備

大鼠分成對照組(n=20)、模型組(n=20)、高劑量GSPE組(n=20)、低劑量GSPE組(n=20)。模型組和GSPE各組每天8:00～16:00置于低氧艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)充入氮氣和空氣，每次循環(huán)2 min，連續(xù)給予氮氣30 s，維持艙內(nèi)氧濃度最低至5%(50 ml/L)，隨后復(fù)氧至氧濃度21%(210 ml/L)。對照組持續(xù)充入壓縮空氣。用數(shù)字測氧儀監(jiān)測艙內(nèi)氧濃度變化，使艙內(nèi)氧濃度維持在預(yù)定的氧濃度內(nèi)(±0.5%)；每天實驗8 h，持續(xù)2或6周。GSPE組在動物進入低氧艙前2周開始每天GSPE灌胃1次，持續(xù)8周。劑量：高GSPE組200 mg/kg，低GSPE組100 mg/kg。分別在實驗第2周和第6周進行檢測。

1.3 電鏡觀察

常規(guī)麻醉動物，開胸暴露心臟，應(yīng)用混合固定液(2.5%戊二醛+2%多聚甲醛的磷酸緩沖液)心臟灌流，斷頭取腦，取大腦海馬組織，切成1×1×1 mm組織塊，40 ml/L戊二醛固定，0.1 mol/L二甲砷酸緩沖液沖洗，共2次；40 ml/L四氧化鋨固定，緩沖液沖洗2次。逐級丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透，包埋，超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡80 kV下觀察并攝片。

1.4 MDA、SOD檢測

大腦海馬組織用冰冷的生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱取組織重量，加9倍量勻漿液勻漿器勻漿(冰水浴中進行)，制成10%勻漿液，3500 r/min離心10 min，取上清液?？捡R斯亮藍顯色法測定腦組織蛋白含量。分光光度計測MDA和SOD吸光度。

1.5 細胞凋亡檢測

大鼠腦組織標本多聚甲醛固定。脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，按TUNEL檢測試劑盒進行操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。每個標本取4張切片，200×光鏡下每張切片在海馬區(qū)隨機選取5個視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，取均值。

1.6 學(xué)習(xí)記憶功能檢測

采用Morris水迷宮[6]進行檢測。每只動物晨起訓(xùn)練5次后分別在上午、下午各測試6次，分別記錄各組大鼠逃避潛伏期及撤去平臺后動物穿越原平臺位置的次數(shù)，取均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以(±s)表示，進行單因素方差分析。顯著性水平α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 電鏡觀察

對照組大鼠海馬神經(jīng)元細胞核規(guī)則，核仁清晰，核質(zhì)均勻散在，核膜光滑，邊緣清晰，神經(jīng)元內(nèi)細胞器，包括高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、多聚核糖體、線粒體、溶酶體等豐富，結(jié)構(gòu)正常；突觸結(jié)構(gòu)完整清晰。模型組低氧2周時，神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)變化不明顯，細胞器數(shù)量豐富，結(jié)構(gòu)較完整；低氧6周可見細胞核染色質(zhì)邊集，線粒體數(shù)量、糖原顆粒數(shù)量明顯減少，細胞器消失，突觸小泡不能辨認。GSPE組腦組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，突觸仍能分辨出且數(shù)量較多；高劑量GSPE組海馬超微結(jié)構(gòu)損傷減輕程度最為顯著。見圖1和圖2。

2.2 MDA和SOD

與對照組比較，模型組海馬區(qū)MDA含量增高，SOD活性下降；隨低氧時間延長，MDA含量進一步增高，SOD活性進一步下降。與模型組比較，GSPE組MDA含量降低，SOD活性提高，以高劑量GSPE組更為顯著。見表1。

2.3 神經(jīng)細胞凋亡

與對照組比較，模型組海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量增加，且隨低氧時間的延長，神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量基進一步升高；與模型組比較，GSPE組可有效降低凋亡神經(jīng)細胞數(shù)量，且在高劑量GSPE組變化更為顯著。見表1。

2.4 水迷宮測試

與對照組相比，模型組逃避潛伏期延長，穿越平臺位置次數(shù)減少；與模型組比較，GSPE組逃避潛伏 期縮短，穿越原平臺位置次數(shù)增加(P＜0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(透射電鏡，20,000×)

圖2 各組大鼠海馬區(qū)突觸形態(tài)變化(透射電鏡，20,000×)

表1 各組測評指標比較

3 討論

睡眠呼吸暫停綜合征患者認知功能障礙主要表現(xiàn)為注意、集中、記憶和復(fù)雜問題解決能力等受損。水迷宮中逃避潛伏期反映大鼠有效獲取有效學(xué)習(xí)能力，而檢測穿越原平臺位置次數(shù)反映記憶的保持能力。結(jié)果顯示，GSPE可改善睡眠呼吸暫停低氧導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶損傷。

睡眠呼吸暫停綜合征引起的間歇性低氧使腦組織因氧耗竭而導(dǎo)致氧自由基轉(zhuǎn)化代謝異常，產(chǎn)生大量氧自由基，超出細胞內(nèi)抗氧化防御體系，如SOD及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)等的防御清除能力[7-8]。而低氧環(huán)境可引起離體海馬突觸長時間阻滯，對突觸可塑性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致細胞功能喪失[9]；此外長期間歇性低氧類似于缺血再灌注損傷，可導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡[10]。

GSPE抗氧化能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍，與SOD相當(dāng)[11]。譚毓治等報道，GSPE能改善D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，增強正常小鼠信息的保持和再現(xiàn)能力，與其能降低血液和腦組織中過氧化脂質(zhì)有關(guān)[12]。本研究應(yīng)用GSPE預(yù)處理動物，對睡眠呼吸暫停低氧大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)及認知功能有良好的改善作用。

GSPE具有多種藥理活性。其改善睡眠呼吸暫停綜合征引起的神經(jīng)損傷的其他機制有待進一步探討。

[1]鄭慶,楊宇.阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征與認知功能障礙及癡呆[J].中國老年學(xué)雜志,2008,28(12):2392-2393.

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Effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Ultrastructure Injury in Hippocampous and Cognition Impairment in Rats of Obstructive Sleep Apnea Hypoxia

ZHAO Ya-ning,LIU Wen-qian,CAO Shu-hua,et al.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300000,China

ObjectiveTo investigate the effect of grape seed proanthocyanidin extract(GSPE)on ultrastructure injury in hippocampous and cognition impairment in rat model of obstructive sleep apnea hypoxia.Methods80 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group,model group,high and low dose GSPE groups.The control group was exposed in air,while the model group was suffered from intermittent hypoxia conditions(50 ml/L,8 h everyday,for 2 or 6 weeks),and the GSPE groups accepted GSPE 200 mg/kg or 100 mg/ kg 2 weeks respectively before hypoxia.Pathology in hippocampal region was observed under electromicroscope.Malondialdehyde(MDA) contents and superoxide dismutase(SOD)activity were detected with colorimetry,and apoptotic cells were measured with TUNEL.The cognition function of rats was assessed with the Morris water maze(MWM).ResultsThe ultrastructure in hippocampous was significantly injured,with the increase of MDA and decrease of SOD(P＜0.001)in the model group.The apoptotic cells increased(P＜0.001).The escaping latency prolonged(P＜0.001)and the frequency of crossing the platform decreased(P＜0.001)in MWM test in the model group.Compared with the model group,the GSPE groups decreased in MDA content,increased in SOD level,decreased in apoptotic cells and ultrastructure damages,shortened the escaping latency,and increased the frequency of crossing the platform(P＜0.001),especially in the high dose group (P＜0.05).ConclusionGSPE can relieve the damage of ultrastructure and improve cognition function after obstructive sleep apnea hypoxia in rats.

sleep apnea;learning;memory;hippocampus;malondialdehyde;superoxide dismutase;apoptosis;rats

R742

A

1006-9771(2014)03-0236-04

2013-05-23

2013-07-23)

河北省教育廳重點資助項目(No.ZH2012046)。

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市300000；2.河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，河北唐山市063000；3.天津市第一中心醫(yī)院，天津市300000。作者簡介：趙雅寧(1974-)，女，河北唐山市人，博士，副教授，主要研究方向：腦損傷與腦保護。通訊作者：曹書華。

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.03.010