陳江君，劉寧，陳軍

紅景天對大鼠腦缺血再灌注c-Fos表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響①

陳江君，劉寧，陳軍

目的 探討紅景天對大鼠腦缺血再灌注后腦組織中c-Fos表達(dá)水平及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法Wistar大鼠120只，分為假手術(shù)組、模型組和干預(yù)組(紅景天)，各組再分為3 h、6 h、12 h、24 h、48 h共5個亞組，每個亞組8只大鼠。后兩組采用大腦中動脈線栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型，干預(yù)組術(shù)前紅景天每天0.672 g/kg灌胃15 d。參考Longa法在大鼠麻醉清醒后進(jìn)行評分，應(yīng)用免疫組化、TUNEL法檢測各組c-Fos表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果模型組和干預(yù)組缺血腦組織中c-Fos表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，于再灌注48 h達(dá)高峰；與模型組相比，干預(yù)組c-Fos表達(dá)減少(P＜0.05)，神經(jīng)元凋亡明顯減少(P＜0.01)，神經(jīng)功能缺損評分下降(P＜0.05)。結(jié)論紅景天能抑制大鼠腦缺血再灌注后腦組織中c-Fos表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡，減輕缺血再灌注損傷。

紅景天；缺血再灌注；c-Fos；神經(jīng)元；凋亡

[本文著錄格式]陳江君，劉寧，陳軍.紅景天對大鼠腦缺血再灌注c-Fos表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2014,20(3):233-235.

缺血性腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，死亡率、致殘率高，嚴(yán)重影響人民群眾的生命安全及生活質(zhì)量[1]。腦缺血后恢復(fù)腦血流是治療腦缺血最關(guān)鍵的方法，但再灌注后可加重缺血腦組織的損傷。這種損傷以凋亡為主，減少缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡為重要的腦保護(hù)機制。

c-Fos與細(xì)胞凋亡的關(guān)系爭議較多[2-3]。實驗研究顯示，長期應(yīng)用紅景天(Rhodiola Rosae P.E)對腦缺血再灌注具有一定的保護(hù)作用。本研究擬從蛋白水平觀察大鼠缺血再灌注后海馬組織c-Fos表達(dá)水平與神經(jīng)細(xì)胞凋亡關(guān)系，并闡釋紅景天腦保護(hù)作用的部分機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3～4月齡健康雄性Wistar大鼠120只，體重220～250 g，由蘭州大學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2 試劑 紅景天：西藏諾迪康藥業(yè)股份有限公司，批號：Z10980020。c-Fos單克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、多聚賴氨酸及凋亡檢測試劑盒：南京中杉生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠分為假手術(shù)組、模型組和干預(yù)組，各組再分為3 h、6 h、12 h、24 h和48 h共5個亞組，每個亞組8只。干預(yù)組術(shù)前予紅景天每天0.672 g/ kg灌胃15 d，假手術(shù)組、模型組每天予等量生理鹽水灌胃15 d。

1.2.2 動物模型制備 根據(jù)Longa[4]的改良線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)2 h后再灌注模型。

1.3 行為學(xué)評分

參考Longa的5分法在大鼠麻醉清醒后進(jìn)行評分。0分：無神經(jīng)損傷癥狀。1分：不能完全伸展對側(cè)前爪。2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。3分：向?qū)?cè)傾倒。4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.4 c-Fos免疫組化染色

采用SABC法，參照免疫組化試劑盒說明書操作。c-Fos蛋白陽性細(xì)胞為胞漿和胞核著色呈棕黃色。每張切片選擇缺血灶周圍6個不連續(xù)的高倍視野(400×)，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.5 TUNEL法檢測

石蠟包埋大鼠腦組織塊，海馬平面連續(xù)冠狀切片，厚4 μm。試劑盒染色，光鏡觀察凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。結(jié)果用(±s)表示。各組比較采用單因素方差分析方法(Oneway-ANOVA)，方差齊用Bonferroni檢驗，方差不齊用Tamhanet檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評分

大鼠清醒后均出現(xiàn)輕重不等的神經(jīng)功能缺損癥狀；與模型組比較，干預(yù)組于術(shù)后各時間點均明顯降低(P＜0.01)。見表1。

2.2 c-Fos免疫組化染色

假手術(shù)組見極少量陽性細(xì)胞；模型組再灌注3 h腦組織海馬CA1區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)增加，48 h達(dá)高峰，72 h仍有表達(dá)(P＜0.01)。干預(yù)組c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)在缺血后各時間點均較模型組明顯減少(P＜0.01)。見表2。

2.3 神經(jīng)元凋亡數(shù)

假手術(shù)組海馬CA1區(qū)有少量凋亡細(xì)胞。模型組再灌注3 h后，CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，48 h最多(P＜0.01)。干預(yù)組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少(P＜0.01)。見表3。

表1 各組行為學(xué)評分比較

表2 各組c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)比較

表3 各組神經(jīng)元凋亡數(shù)比較(/100 μm2)

3 討論

腦血管病是人類死亡的三大殺手之一，其中70%為腦梗死。尋找對腦梗死有效的治療途徑，是目前國內(nèi)外學(xué)者共同關(guān)心的課題。腦組織海馬CA1區(qū)對腦缺血最為敏感，即使短暫的腦缺血也可造成延遲性神經(jīng)元死亡(DND)，DND主要機制為細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是缺血后腦細(xì)胞丟失的一種形式。凋亡調(diào)節(jié)基因如bcl-2、bax可能在腦細(xì)胞凋亡過程中起重要作用；此外，興奮性氨基酸如谷氨酸、Ca2+、自由基、血小板凝集因子(PAF)等亦參與凋亡過程[5]。Chandrasekar等注意到，在缺血過程中，c-fos、c-jun等基因較早表達(dá)[6]；c-fos、c-jun家族基因產(chǎn)物通過亮氨酸拉鏈形成可結(jié)合至核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子位點的異二聚體，從而選擇性調(diào)控遲發(fā)性基因的表達(dá)。

c-fos原癌基因研究始于20世紀(jì)80年代中后期，因與小鼠成骨肉瘤中致癌基因v-fos同源，故稱為cfos原癌基因[7]，它屬于即刻早期基因。一般情況下，c-fos基因在許多組織低水平表達(dá)，可能與DNA損傷及修復(fù)相關(guān)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，與細(xì)胞的生長、繁殖、分化、信息傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等眾多生理功能有關(guān)；當(dāng)受到外界如缺血、缺氧等刺激時，表達(dá)水平會有顯著改變[8]，可出現(xiàn)過度表達(dá)，其產(chǎn)物Fos蛋白由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與c-jun基因的產(chǎn)物Jun蛋白形成Fos-Jun異源二聚體，作用于DNA的特殊序列，調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮第三信使的作用，進(jìn)而干預(yù)細(xì)胞核的修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。也有研究表明，c-fos基因的表達(dá)能抑制腦缺血后神經(jīng)元死亡或凋亡的程度，c-fos基因表達(dá)越高，相應(yīng)的腦組織損傷越輕[10]。

紅景天主要成分有紅景天苷、多種黃酮和人體必需的18種氨基酸、多種微量元素。它通過黃酮類化合物對血管壁的軟化作用，以及血液流變學(xué)的改變實現(xiàn)對腦血管的保護(hù)作用；其中黃酮及紅景天苷能祛除血液中過多的脂質(zhì)成分和沉積在血管上的脂質(zhì)，對過氧化脂質(zhì)生成有明顯抑制作用，具有抑制血小板聚集，抗氧化應(yīng)激及改善微循環(huán)等作用。以往的研究顯示，紅景天可能通過多種途徑，保護(hù)缺血腦組織、挽救缺血半暗帶，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

他汀類藥物能通過調(diào)節(jié)c-Fos等炎癥介質(zhì)的活性，減輕動脈粥樣硬化病變中的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的作用。本研究結(jié)果顯示，大鼠腦組織缺血再灌注3 h后，c-Fos蛋白表達(dá)增加，同時CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量增加。提示c-Fos在神經(jīng)元中的出現(xiàn)是凋亡發(fā)生的信號。

[1]蔡紫峰,楊卓.腦缺血損傷的研究進(jìn)展[J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育, 2004,18(4):53-55.

[2]Koennecke HC.Editorial comment—challenging the concept of adynamic penumbra in acute ischemic stroke[J].Stroke, 2003,34(10):24-34.

[3]Nagasawa H,Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,1989,20(8):1037-1043.

[4]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke,1989,20(1):84-91.

[5]Espinoza MI,Parer JT.Mechanisms of asphyxial brain damage,and possible pharmacologic interventions,in the fetus[J]. Am J Obstet Gynecol,2005,164(6):1582-1589.

[6]Chandrasekar B,Mummidi S,Mahimainathan L,et al.Interleukin-18-induced human coronary artery smooth muscle cell migration is dependent on c-fos and AP-1-mediated matrix metalloproteinase-9 expression and is inhibited by atorvastatin[J].J Biol Chem,2006,281(22):15099-15109.

[7]Morgan JI，Curran T.Stimulustranscription coupling in the nervous system:involvement of the inducible protooncogenes fos and jun[J].Ann RevNeurosci,1991,14:421-451.

[8]Rau SW,Dubal DB,B?ttner M,et al.Estradiol differentially regulates c-Fos after focal cerebral ischemia[J].J Neurosci, 2003,23(33):10487-10494.

[9]Schbitz WR,Schade H,Heiland S,et al.Neuroprotection by hyperbaric oxygenation after experimental focal cerebral ischemia monitored by MRI[J].Stroke,2004,35(5):1175-1179.

[10]Whitfield J,Neame SJ,Paquet L,et al.Dominant-negative c-Jun promotes neuronal survival by reducing BIM expression and inhibiting mitochondrial cytochrcmec release[J].Neuron, 2001,29(3):629-643.

Effects of Rhodiola on Expression of c-Fos and Neuronal Apoptosis after Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury in Rats

CHEN Jiang-jun,LIU Ning,CHEN Jun.Department of Neurology,First Hospital of Lanzhou University,Lanzhou 730000,Gansu,China

ObjectiveTo investigate the effect ofRhodiola Rosae P.Eon the expression of c-Fos and the apoptosis of neuronal in rat brain after ischemia/reperfusion(I/R)injury.Methods120 Wistar rats were divided into sham group,model group and intervention group, subgrouped as 3 h,6 h,12 h,24 h,and 48 h.The model and intervention groups underwent middle cerebral artery occlusion,and the latter accepted Rhodiola 0.672 g/kg daily for 15 d.They were assessed with Longa's score.The expression of c-Fos and apoptosis of neuronal were measured with immunohistochemistry and TUNEL.ResultsThe expression of c-Fos in the ischemic area increased after cerebral ischemia/reperfusion(P＜0.01),peaking at 24 h after injury,and decreased in the intervention group(P＜0.01),with the decrease of neuron apoptosis and Longa's score(P＜0.01).ConclusionRhodiola protects the brain tissue against ischemia/reperfusion injury by inhibiting the expression of c-Fos and apoptosis in rats.

Rhodiola;ischemia/reperfusion;c-Fos;neuron;apoptosis

R743.3

A

1006-9771(2014)03-0233-03

2013-07-15

2013-09-11)

甘肅省自然科學(xué)基金項目(No.1107RJYA072)。

蘭州大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅蘭州市730000。作者簡介：陳江君(1978-)，男，漢族，甘肅蘭州市人，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科腦血管病工作。

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.03.009