馬璟曦，羅勇

·專題·

電針合谷穴對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦內(nèi)毛細血管密度及CD34表達的影響①

馬璟曦1，羅勇2

目的 觀測電針大鼠雙側合谷穴(LI04)對局灶性腦缺血再灌注后腦內(nèi)CD34表達及血管新生的影響。方法90只大鼠隨機分為正常組(n=6)、模型組(n=42)和電針組(n=42)。模型組和電針組采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，電針組采用電針治療。局灶性腦缺血1 h后再灌注，觀察再灌注后2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d共7個時相點大鼠神經(jīng)癥狀學評分，采用HE染色觀察并計算梗死體積和毛細血管密度，免疫組織化學法檢測CD34的表達。結果電針組與模型組比較，再灌注后各時間點神經(jīng)癥狀學評分降低(P＜0.05)。電針組梗死體積顯著小于模型組(P＜0.001)。與模型組相比，電針組毛細血管密度再灌注后2 h開始增加(P＜0.05)，再灌注后24 h到再灌注后14 d均較模型組明顯增加(P＜0.01)。電針組再灌注后3 d CD34陽性細胞表達較模型組明顯增加(P＜0.01)，7 d增加達高峰(P＜0.01)，14 d仍有顯著性差異(P＜0.05)。結論電針能促進局灶性腦缺血再灌注后CD34的表達，增加毛細血管密度，促進血管新生。

缺血再灌注；電針；毛細血管密度；CD34；大鼠

[本文著錄格式]馬璟曦，羅勇，等.電針合谷穴對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦內(nèi)毛細血管密度及CD34表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2014,20(3):201-205.

腦缺血損傷后神經(jīng)修復過程包括神經(jīng)發(fā)生、突觸重塑和血管新生。新生血管可以為缺血組織重新提供必需的氧氣和營養(yǎng)，并且為新生神經(jīng)元提供神經(jīng)營養(yǎng)支持。神經(jīng)發(fā)生和血管新生的作用機制可能是相互聯(lián)系的。研究表明，缺血區(qū)周圍毛細血管密度高的腦卒中患者存活時間更長[1]。因此，刺激腦內(nèi)毛細血管生成的干預措施可能成為臨床治療缺血性腦卒中的手段之一。腦缺血后的血管生成分為血管發(fā)生(vasculogenesis)、血管新生(angiogenesis)和動脈形成(arteriogenesis)三個相互聯(lián)系的過程[2]。血管新生是成人腦缺血后血管生成三種方式中最主要的一種，也是現(xiàn)在主要的研究方向。本文在課題組原有研究工作的基礎上[3-4]，進一步觀察局灶性腦缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)血管內(nèi)皮細胞(CD34標記)的生成和毛細血管密度以及電針合谷穴(LI04)對它們的影響，初步探討電針對內(nèi)源性血管新生的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

成年健康雄性Wistar大鼠90只，體重250～300 g，隨機分為正常組(n=6)、局灶性腦缺血再灌注模型組(模型組，n=42)、局灶性腦缺血再灌注＋電針治療組(電針組，n=42)。后兩組分別分為腦缺血再灌注后2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d共7個時相點，每個時相點6只。正常組不作特殊處理。

1.2 局灶性腦缺血再灌注模型制備

線栓法制備右側大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型。3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉(1 ml/100 g)，大鼠仰臥位固定，經(jīng)頸部正中切口依次暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈顱外段。在頸外動脈殘端作一環(huán)形切口，將預先處理的栓子尼龍繩線向頸內(nèi)動脈顱內(nèi)方向插入17～20 mm，如遇阻力，表明線栓頭端已通過大腦中動脈起始部，造成缺血。1 h后拔回線栓至頸外動脈的殘端，完成再灌注。模型成功的判斷標準[5]：①左側肢體疼痛回縮遲鈍或不出現(xiàn)；②行走時向左側偏倒或原地向左側旋轉；③提尾倒懸時左上肢不向前下伸；④右側出現(xiàn)Honer氏征。

1.3 神經(jīng)癥狀學評分[6]

大鼠清醒后評分。0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺失(不能完全伸展左側前肢)；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺失(向左側轉圈)；3分：中度局灶性神經(jīng)功能缺失(向左側傾倒)；4分：不能自發(fā)行走，意識水平降低。

1.4 電針刺激方法及參數(shù)

電針組參照中國針灸學會實驗針灸委員會實驗動物穴位圖譜，選取雙側合谷穴(LI04)為電針穴位。局灶性腦缺血后45 min，電針刺激上述穴位。每次電針時間為15 min。刺激參數(shù)：疏密波F1=40 Hz，F(xiàn)2=60 Hz，空載輸出電壓1.5 V。對超過1 d的時相點，每天電針1次，最多電針7 d，7 d后自然喂養(yǎng)，不作特殊處理。

1.5 取材

每組動物到達相對應時相點時，麻醉后用生理鹽水200 ml快速左心室灌注沖洗，再用4%多聚甲醛(pH 7.4的0.1 mol/L PBS配置)加0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)500 ml先快后慢灌注固定，斷頭取腦，制備石蠟切片。取相鄰切片用于HE染色及免疫組化。

1.6 梗死體積測定

切片脫蠟，HE染色，每隔200μm取一張切片，利用網(wǎng)格計數(shù)器對不同平面梗死灶面積進行計數(shù)，然后根據(jù)梯形法則算每只大鼠梗死灶面積：

V代表梗死灶體積，t代表相鄰切片間的距離，A代表每個所選切片的梗死灶面積。觀察比較局灶性腦缺血大鼠穴位電針刺激前后梗死灶體積變化。

1.7 毛細血管密度測定

切片脫蠟，HE染色，在400倍視野下計數(shù)毛細血管(由單個內(nèi)皮細胞核圍成管壁，管腔直徑＜10μm)，取5個連續(xù)缺血區(qū)域視野下的均值，以毛細血管數(shù)/ mm2表示毛細血管密度。

1.8 CD34免疫組化檢測

切片脫蠟至水，抗原熱修復92～98℃15 min，滴加封閉液，滴加1∶75小鼠抗大鼠CD34單克隆抗體(Santa Cruz公司)4℃過夜，滴加SABC。DAB顯色、脫水、透明、封片。陽性細胞計數(shù)：在400倍視野下計數(shù)，以胞漿染成棕黃色為陽性細胞。

1.9 統(tǒng)計學分析

每只動物隨機選取3張非連續(xù)切片，每張切片取10個不連續(xù)視野的均值。每組數(shù)據(jù)用(±s)表示，用SPSS 12.0軟件進行t檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 神經(jīng)癥狀學評分

電針組與模型組比較，再灌注后2 h、12 h、24 h、3 d神經(jīng)癥狀學評分明顯降低(P＜0.01)；再灌注后7 d、14 d、21 d神經(jīng)癥狀學評分降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)癥狀學評分比較

2.2 梗死體積

對連續(xù)的腦缺血組織切片(包括視交叉后2～4 mm)，HE染色發(fā)現(xiàn)，電針組再灌注1 d后在冠狀切面上梗死灶累及范圍比模型組小，電針組梗死體積(53.86±4.11)mm3顯著小于模型組(75.45±4.43)mm3(t= 8.754,P＜0.001)。

2.3 毛細血管密度

正常組：毛細血管密度是(132.4±9.5)/mm2。

模型組：再灌注后2 h～21 d均較正常組明顯增加(P＜0.01)，表達增加趨勢呈單峰，表達高峰是再灌注后14 d(P＜0.01)。

電針組：再灌注后2 h～21 d均較正常組顯著增加(P＜0.001)，表達高峰是再灌注后7 d，高峰出現(xiàn)時間較模型組早。電針組與模型組相比，除再灌注后12 h、21 d外，各時間點均增加(P＜0.05)。見表2。

2.4 CD34陽性細胞(血管內(nèi)皮細胞)計數(shù)

CD34陽性細胞主要是在內(nèi)皮細胞較早期表達，以它作為血管內(nèi)皮細胞計數(shù)。

模型組CD34陽性細胞數(shù)在再灌注后2 h與正常組無顯著性差異(P＞0.05)，但仍存在增加的趨勢。從再灌注后12 h到再灌注后14 d CD34陽性細胞表達逐漸增加(P＜0.01)，持續(xù)時間較長，直到14 d達高峰，21 d仍未回到正常組水平(P＜0.01)。見表3。缺血壞死區(qū)周圍大腦皮質(zhì)表達明顯增多，排列密集，且強陽性表達，側腦室脈絡膜、室管膜細胞及周圍小血管的內(nèi)皮細胞胞漿呈棕黃色。缺血區(qū)內(nèi)殘存細胞形態(tài)不清楚，界限不清晰，但仍可見陽性表達。缺血區(qū)周圍新生細胞不成熟，形態(tài)不完整。見圖1。

電針組(見圖2)CD34陽性細胞數(shù)在再灌注后2 h～21 d均較正常組明顯升高(P＜0.01)，高峰出現(xiàn)在再灌注后7 d，表達部位同模型組，但更加廣泛。電針組與模型組比較，再灌注后2 h到再灌注后24 h CD34陽性細胞表達逐漸增加，但無顯著性差異(P＞0.05)。3 d后有顯著性差異(P＜0.01)，14 d仍有顯著性差異(P＜0.05)，21 d無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。缺血側較缺血對側表達明顯增加，缺血區(qū)殘存細胞界限模糊，缺血區(qū)周圍內(nèi)皮細胞計數(shù)增多圍繞梗死灶帶狀近似環(huán)形分布。見圖2。

表2 各組毛細血管密度比較(/mm2)

表3 各組CD34陽性細胞(血管內(nèi)皮細胞)計數(shù)比較

圖1 模型組7 d CD34陽性細胞表達(免疫組化染色，400×)

圖2 電針組7 d CD34陽性細胞表達(免疫組化染色，400×)

3 討論

3.1 血管發(fā)生與血管新生

血管發(fā)生指原始血管網(wǎng)的形成，通過血管母細胞分化成內(nèi)皮細胞形成迷宮樣的血管網(wǎng)絡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針合谷穴能增加局灶性腦缺血再灌注大鼠外周血和骨髓內(nèi)皮祖細胞數(shù)量[7]。蔡紹皙等發(fā)現(xiàn)，電針足三里穴和曲池穴能增加局灶性腦缺血再灌注大鼠外周血內(nèi)皮祖細胞數(shù)量[8]。這是電針激活局灶性腦缺血再灌注后血管發(fā)生的過程的可能機制之一。而血管新生是指新生的毛細血管從已存在的血管側支的出芽與再塑。包括三個連續(xù)的環(huán)節(jié)：①血管舒張，內(nèi)皮通透性增加，基底膜溶解；②內(nèi)皮細胞增生、遷移；③管腔形成，再塑，內(nèi)皮細胞分化成熟。因此，血管發(fā)生和血管新生是動態(tài)和連續(xù)的過程。本研究在前期研究的基礎上，觀察電針對新生血管內(nèi)皮細胞的影響。

3.2 血管內(nèi)皮細胞標記

腦缺血后內(nèi)源性血管生成機制被激活，怎樣衡量血管新生情況、計數(shù)血管內(nèi)皮細胞，國內(nèi)外尚沒有一個統(tǒng)一的金標準。作為血管內(nèi)皮細胞的表達標志有CD34、CD31和因子Ⅷ相關抗原等。目前將同時具有CD34、AC133、VEGFR2三種表面標志的細胞作為早期功能性的內(nèi)皮祖細胞。CD34＋/AC133＋/VEGFR2＋細胞經(jīng)過血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等誘導分化后，CD34和AC133表達逐漸減弱，并開始表達內(nèi)皮細胞表面特有的分子標志如CD31和因子Ⅷ相關抗原等，而VEGFR2繼續(xù)表達，最終轉化為成熟的血管內(nèi)皮細胞。因此可以看出，CD34主要在內(nèi)皮細胞分化較早期表達，而成熟血管內(nèi)皮細胞表達較弱。CD34作為新生血管內(nèi)皮細胞的表達標志，陽性細胞作為血管內(nèi)皮細胞的計數(shù)可能較CD31和因子Ⅷ相關抗原更準確反映新生血管內(nèi)皮細胞的情況。既往實驗有電針對CD31[9]和因子Ⅷ相關抗原[10]表達影響的報道，而沒有電針對CD34表達影響的報道。毛細血管密度能更加直接反映機體血管生成的程度。我們計數(shù)有形態(tài)的毛細血管(直徑＜10μm)，更能反映有功能的新生血管狀態(tài)。

3.3 電針與內(nèi)源性血管新生

Du等研究發(fā)現(xiàn)，電針對MCAO大鼠促進血管內(nèi)皮細胞增生(采用ki67和vWF雙標記)，增加缺血周圍腦血流量(采用激光多普勒流量計探測)，并改善神經(jīng)功能評分[11]。毛慶菊等采用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，電針對MCAO/R大鼠大腦皮層微血管超微結構形態(tài)學損傷具有明顯的保護作用，可促進VEGF表達并調(diào)控血管新生[12]。萬賽英等發(fā)現(xiàn)，電針對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與促進腦缺血區(qū)的血管新生有關[13]。

本實驗觀察到毛細血管密度在MCAO/R后增加，于再灌注后14 d達到高峰。這說明腦缺血后立即啟動機體自身的血管生成機制。電針組毛細血管密度在MCAO/R后增加，高峰提前到再灌注后7 d，持續(xù)時間更長，比模型組的表達增加更加顯著。CD34陽性細胞計數(shù)在MCAO/R后持續(xù)增加，速度由快變慢。表達高峰在再灌注14 d，較正常組顯著增加。電針組CD34陽性細胞計數(shù)在MCAO/R后持續(xù)增加，且較模型組增加幅度更加明顯，高峰提前在再灌注后7 d。以上結果表明，電針能激活大鼠腦組織內(nèi)內(nèi)源性血管新生機制。本課題組前期研究提示其機制可能與以下有關：上調(diào)血管生長因子VEGF、Ang-1和下調(diào)血管抑制因子Endostatin表達[3]；上調(diào)胎盤生長因子及其受體Flt-1的表達[14]；上調(diào)基質(zhì)細胞衍生因子-1α表達[15]；上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶及基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達[16]；加強PI3K/AKT信號轉導通路的激活[17]；上調(diào)干細胞因子(SCF)及其受體c-kit、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達[18]。電針促進內(nèi)源性血管新生的機理仍有待進一步的研究。

3.4 電針與局灶性腦缺血再灌注

本實驗觀察到，電針可減少MCAO/R大鼠梗死體積，改善神經(jīng)癥狀學評分，促進神經(jīng)功能恢復。其機理可能與電針促進CD34陽性細胞表達，促進血管內(nèi)皮細胞增生，增加毛細血管密度，激活內(nèi)源性血管新生相關。作為具有代表性的傳統(tǒng)非藥物療法，針刺具有整體的良性調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究還提示，電針對MCAO/R大鼠通過上調(diào)bFGF促進神經(jīng)干細胞的增殖、遷移[19]。張運康等研究發(fā)現(xiàn)，電針通過增加腦梗死側海馬區(qū)VEGF的表達來促進血管新生，進而誘導內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖[20]。黃瀏嬌等研究發(fā)現(xiàn)，電針增加腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)大鼠皮層微血管密度，促進神經(jīng)功能恢復[21]。李占標等研究發(fā)現(xiàn)，針刺降低局灶性腦缺血大鼠缺血側大腦皮層的細胞凋亡，提高皮層蛋白激酶A表達，促進神經(jīng)修復與再生[22]。Hong等研究發(fā)現(xiàn)，電針通過調(diào)節(jié)維甲酸信號通路改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能[23]。

綜上所述，電針對神經(jīng)血管單元[24]具有整體的良性調(diào)節(jié)作用。電針對腦缺血再灌注可發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多水平、多層次、多途徑的調(diào)節(jié)作用，有利于全面促進整個腦缺血后的血管新生和神經(jīng)功能恢復。本研究結果提示，電針促進神經(jīng)功能康復可能與電針促進神經(jīng)發(fā)生、血管生成兩方面都有關。電針促進血管內(nèi)皮細胞增生，增加毛細血管密度，如何進一步促進神經(jīng)功能恢復，電針對神經(jīng)血管單元中各成分的影響及它們的相互作用，這些問題仍有待進一步的研究。

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Effect of Electroacupuncture at Hegu(LI04)on Capillary Density and Expression of CD34after Focal Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats

MA Jing-xi,LUO Yong.Chongqing Zhongshan Hospital,Chongqing 400013,China

ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture at Hegu(LI04)on capillary density and expression of CD34after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats.Methods90 rats were randomly divided into normal group(n=6),model group(n=42)and electroacupuncture group(n=42).A rat model of focal cerebral ischemia/reperfusion was made by filament occlusion in the model group and the electroacupuncture group.And the electroacupuncture group received electroacupuncture.They were observed 2 h,12 h,24 h,3 d,7 d,14 d,21 d after reperfusion 1 h followed ischemia.HE staining was used to observe and calculate the infarct volume and capillary density,and immunohistology was used to detect the expression of CD34after neurologic symptoms rating.ResultsCompared with the model group,the neurologic symptoms score significantly decreased 2 h after reperfusion in the electroacupuncture group(P＜0.01),and still decreased 21 d after reperfusion(P＜0.05).The infarct volume significantly was smaller in the electroacupuncture group than in the model group(P＜0.01).The capillary density was higher 2 h,24 h,3 d,7 d,14 d after reperfusion in the electroacupuncture group than in the model group(P＜0.05).Compared with the model group,the expression of CD34significantly increased 3 d after reperfusion in the electroacupuncture group(P＜0.01), and it reached a peak at 7 d after reperfusion(P＜0.01),and still higher at 14 d.ConclusionElectroacupuncture can promote the expression of CD34and the capillary density,and stimulate the angiogenesis after focal ischemia/reperfusion.

ischemia/reperfusion;electroacupuncture;capillary density;CD34;rats

R743.3

A

1006-9771(2014)03-0201-05

2013-05-06)

1.教育部“高等學校博士學科點專項科研基金”項目(No.20095503110001)；2.重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研項目(No.2005-B-24;No. ZY20131027)。

1.重慶市中山醫(yī)院，重慶市400013；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶市神經(jīng)病學重點實驗室，重慶市400016。作者簡介：馬璟曦(1980-)，男，回族，湖南隆回縣人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：腦血管病。通訊作者：羅勇，男，博士生導師。

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.03.001