楊小敏潘 丹陳艷梅鄭 翔馮國(guó)飛徐曉武

1浙江省溫州市人民醫(yī)院病理科 溫州 325000 2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科

乳腺癌組織HIF-1α和Sema 4D表達(dá)及其與淋巴管密度和各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

楊小敏1潘 丹1陳艷梅1鄭 翔1馮國(guó)飛1徐曉武2

1浙江省溫州市人民醫(yī)院病理科 溫州 325000 2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科

目的 通過檢測(cè)HIF-1α和Sema 4D在乳腺癌組織表達(dá)，探討其與淋巴管密度（LVD）和臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)110例乳腺癌組織標(biāo)本HIF-1α和Sema 4D表達(dá)，檢測(cè)微淋巴管密度（LVD），依據(jù)不同臨床病理特征分組并進(jìn)行組間比較，并與乳腺纖維腺瘤組織標(biāo)本對(duì)照。結(jié)果 乳腺癌組織HIF-1α和Sema 4D陽性表達(dá)率分別為72.72%（80/110）和77.27%（85/110）；HIF-1α與Sema 4D表達(dá)呈正相關(guān)性（r=0.691，P＜0.01）。乳腺癌組織LVD顯著高于纖維腺瘤組（P＜0.01），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組LVD顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.01）；pTNMⅠ～Ⅱ期組、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組癌組織HIF-1α和Sema 4D表達(dá)陽性率明顯低于pTNMⅢ期組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05，P＜0.01），不同年齡、組織學(xué)分級(jí)、腫塊大小組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 乳腺癌組織HIF-1α、Sema 4D高表達(dá)，可能與淋巴管的增生、轉(zhuǎn)移侵襲有密切關(guān)系。

乳腺癌；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；軸突導(dǎo)向因子4D；淋巴管密度

圖1 A：HIF-1α在癌細(xì)胞核表達(dá)（HE ×200）；B：Sema4D在癌細(xì)胞漿表達(dá)（HE ×200）

圖2 乳腺癌組織D2-40表達(dá)陽性的淋巴管（HE ×200）

缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是腫瘤細(xì)胞缺氧適應(yīng)的中心調(diào)節(jié)因子，在多種人類惡性腫瘤早期即發(fā)現(xiàn)HIF-1α的過度表達(dá)，與腫瘤生長(zhǎng)、血管形成、轉(zhuǎn)移有關(guān)[1]。軸突導(dǎo)向因子4D（semaphorin4D，Sema4D）是Semaphorin超家族成員之一，對(duì)腫瘤血管發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移起重要作用[2]。本研究旨通過觀察乳腺癌組織HIF-1α和Sema 4D表達(dá)情況，探討其與淋巴管密度（LVD）和臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2003年—2007年在我院行乳腺癌改良根治術(shù)，臨床資料齊全的女性患者110例，年齡32～68歲，平均46.4歲；術(shù)前均未行放化療及其他治療手段。所有患者的病理切片均由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立復(fù)閱，確診110例均屬浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；其中直徑＜3cm 81例，直徑≥3cm 29例；清除淋巴結(jié)數(shù)均＞15枚；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例，無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。按國(guó)際病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3]：Ⅰ級(jí)30例，Ⅱ級(jí)47例，Ⅲ級(jí)33例。以同期20例女性乳腺纖維腺瘤組織標(biāo)本為對(duì)照，年齡30～50歲，平均40.5歲。

1.2 主要試劑與方法 濃縮型兔抗人HIF-1α多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)BA0912）、抗Sema4D單克隆抗體（BD Biosciences公司，批號(hào)610670）、濃縮液D2-40單克隆抗體（批號(hào)ZM-0465）、DAB試劑盒及SP試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。石蠟標(biāo)本5μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟。采用SP免疫組化法，按照試劑盒內(nèi)說明書操作?？笻IF-1α和抗Sema4D工作液均經(jīng)微波修復(fù)預(yù)處理，抗原修復(fù)液為檸檬酸緩沖液（pH6.0）。D2-40單克隆抗體工作濃度為1:100。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3 HIF-1α及Sema4D表達(dá)結(jié)果判斷 判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞核或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性信號(hào)，陽性細(xì)胞數(shù)＞20%為陽性，＜20%為陰性。

1.4 D2-40免疫組化結(jié)果判定 參照楊小敏等[4]所用方法，檢測(cè)淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（±s） 表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織HIF-1α及Sema 4D表達(dá) HIF-1α陽性信號(hào)定位于細(xì)胞核，Sema4D陽性信號(hào)定位于細(xì)胞漿（圖1，插頁）。110例乳腺癌組織HIF-1α和Sema 4D陽性表達(dá)率分別為72.72%（80/110）和77.27%（85/110）；纖維腺瘤組織未見HIF-1α、Sema 4D表達(dá)，與乳腺癌組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 D2-40表達(dá)、LVD測(cè)定及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

D2-40標(biāo)記的微淋巴管呈棕色，壁薄無肌層，不連續(xù)，腔內(nèi)無紅細(xì)胞（圖2，插頁）。癌旁組織內(nèi)淋巴管較多且多呈擴(kuò)張狀，癌巢內(nèi)淋巴管數(shù)量較少、管腔小或閉鎖狀。纖維腺瘤組織中也可見微淋巴管，但數(shù)量少，管腔小。乳腺癌組織LVD顯著高于纖維腺瘤組（P＜0.01），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組LVD顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1～2。

表1 乳腺癌組織與乳腺纖維腺瘤組織LVD值比較（±s）

表1 乳腺癌組織與乳腺纖維腺瘤組織LVD值比較（±s）

注：與纖維腺瘤組比較，*P＜0.01

組別乳腺癌組纖維腺瘤組n/例110 20 LVD 13.14±3.39* 8.25±2.55

表2 淋巴轉(zhuǎn)移組織與未轉(zhuǎn)移組織LVD值比較（±s）

表2 淋巴轉(zhuǎn)移組織與未轉(zhuǎn)移組織LVD值比較（±s）

注：與無淋巴轉(zhuǎn)移組比較，△P＜0.01

組別淋巴轉(zhuǎn)移組無淋巴轉(zhuǎn)移組n/例63 47 LVD 14.47±3.29△10.26±2.82

2.3 乳腺癌組織HIF-1α與Sema 4D表達(dá)的關(guān)系在HIF-1α表達(dá)陽性的80例乳腺癌中，Sema 4D表達(dá)陽性76例；而HIF-1α表達(dá)陰性的30例乳腺癌中，Sema 4D表達(dá)陽性9例；HIF-1α與Sema 4D及表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.691，P＜0.01）。

2.4 乳腺癌組織HIF-1α、Sema 4D表達(dá)與LVD的關(guān)系 與HIF-1α、Sema 4D表達(dá)陰性組比較，HIF-1α、Sema 4D表達(dá)陽性組有更高的LVD（P＜0.01），見表3～4。

表3 乳腺癌組織HIF-1α表達(dá)與LVD關(guān)系（±s）

表3 乳腺癌組織HIF-1α表達(dá)與LVD關(guān)系（±s）

注：與HIF-1α陰性組比較，▲P＜0.01

組別HIF-1α陽性組HIF-1α陰性組n/例80 30 LVD 13.37±3.75▲10.80±2.99

表4 乳腺癌組織Sema 4D表達(dá)與LVD關(guān)系（±s）

表4 乳腺癌組織Sema 4D表達(dá)與LVD關(guān)系（±s）

注：與Sema4D陰性組比較，▼P＜0.01

組別Sema4D陽性組Sema4D陰性組n/例85 25 LVD 13.49±3.66▼9.88±2.37

2.5 乳腺癌組織HIF-1α、Sema 4D表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 pTNMⅠ～Ⅱ期組、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組癌組織HIF-1α、Sema 4D表達(dá)陽性率明顯低于pTNMⅢ期組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05，P＜0.01）；在不同年齡、組織學(xué)分級(jí)、腫塊大小組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

3 討論

缺氧是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境特征之一；以適應(yīng)這種微環(huán)境，同時(shí)增強(qiáng)腫瘤自身的侵襲性，腫瘤細(xì)率顯著高于pTNMⅠ～Ⅱ期組和淋巴結(jié)陰性組。因此，推測(cè)認(rèn)為：乳腺癌組織中存在淋巴管的新生，腫瘤內(nèi)部LVD增加有利于乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，HIF-1α可以通過上調(diào)其下游基因Sema 4D，從而啟動(dòng)激活受體c-met，使其與細(xì)胞表面的PlexinB1結(jié)合來促進(jìn)腫瘤淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

表5 乳腺癌組織HIF-1α、Sema4D表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

總之，HIF-1α、Sema 4D表達(dá)與乳腺癌內(nèi)淋巴管的增生、轉(zhuǎn)移侵襲有密切關(guān)系，進(jìn)一步研究這兩種蛋白的相互作用機(jī)制，可能對(duì)乳腺癌的預(yù)后及提供新的有效治療措施有一定的臨床意義。胞會(huì)激活一系列相關(guān)分子信號(hào)傳導(dǎo)途徑，分泌一些重要化學(xué)介質(zhì)[5]。HIF-1α是缺氧環(huán)境下被激活的重要轉(zhuǎn)錄因子，在許多實(shí)體瘤中高表達(dá)。HIF-1α下游有100多個(gè)靶基因，HIF-1α與靶基因上的低氧反應(yīng)元件（hypoxic response element，HRE）相結(jié)合使得這些靶基因發(fā)揮各種各樣的功能[6]。軸突導(dǎo)向因子4D（Sema 4D）可通過其表面受體Plexin B1與相應(yīng)的配體c-met結(jié)合來激活受體酪氨酸激酶途徑，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的募集[7]，促進(jìn)淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。既往研究表明[8]，Sema 4D在乳腺癌組織高表達(dá)，它對(duì)腫瘤血管發(fā)生有重要作用。在缺乏Sema 4D的環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞形成腫瘤包塊及轉(zhuǎn)移的能力被嚴(yán)重的削弱[9]。Sun等[10]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以通過上調(diào)其下游基因Sema 4D的表達(dá)，從而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤內(nèi)部血管生成。

本研究結(jié)果顯示，HIF-1α主要在癌細(xì)胞核表達(dá)，Sema 4D主要在癌細(xì)胞漿表達(dá)；它們?cè)谌橄侔┙M中的表達(dá)陽性率大于纖維腺瘤組（P＜0.01）。HIF-1α表達(dá)與Sema 4D表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.691，P＜0.01）。由此可見，在乳腺癌中，HIF-1α可能可以上調(diào)其下游基因Sema 4D表達(dá)。

本研究中LVD結(jié)果與即往研究相似[3，7]。與纖維腺瘤組相比，乳腺癌組織中LVD顯著增高；HIF-1α、Sema 4D陽性表達(dá)組較陰性組有更高的LVD；pTNMⅢ期和淋巴結(jié)陽性組的HIF-1α、Sema4D表達(dá)陽性

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Expressions of HIF-1α and Semaphorin 4D Protein in Human Breast Carcinoma and Their Relationship with Lymphatic Vessel Density and Clinical Pathological Indicators

YANG Xiaomin1,PAN dan1,CHEN Yanmei1,ZHENG Xiang1,FENG Guofei1,XU Xiaowu2. 1.Department of Pathology,the People's Hospital of Wenzhou, Wenzhou (325000),China;2.Department of Gastrointestinal Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

Objective To detect expressions of HIF-1α and semaphorin（Sema）4D in breast carcinoma and explore their correlation with lymphatic vessel density（LVD）and clinical pathological indicators.Methods The expression of HIF-1αand Sema 4D in 110 specimens of breast carcinoma were detected by immunohistochemical SP method and LVD in all specimens was measured.Different clinical pathological features were compared and breast fibroadenoma tissues were used as control group.Results The positive rates of HIF-1α and Sema 4D expression were 72.72%（80/110）and 77.27%（85/110）,respectively.HIF-1α expression were positively correlated with Sema4D expression（r=0.691,P＜0.01）.The LVD were significantly higher in breast carcinoma group than that in breast fibroadenoma group,higher in lymph node metastasis group than that in no lymph node metastasis group（P＜0.01）.The positive rates of HIF-1α and Sema 4D in pTNMⅠ-Ⅱgroup and no lymph node metastasis group were significantly lower than those in pTNMⅢ group and lymph node metastasis group（P＜0.05,P＜0.01）.No significant difference in the positive rates of HIF-1αand Sema 4D was found among different age groups,histological differentiation groups and tumor size groups（P＞0.05）.Conclusion The high expression of HIF-1α and Sema 4D in breast carcinoma may have close relationship with lymphatic hyperplasia,lymph node metastasis,and invasion.

breast neoplasms；hypoxia inducible factor-1α；semaphorin 4D；lymphatic microvessel density

2014-07-28

修回日期：2014-09-23

浙江省溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.Y20100316）