洪朝金郭 勇（指導）

1浙江省人民醫(yī)院腫瘤科 杭州 310014 2浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 杭州 310006

·論 著·

大腸癌圍手術期氣虛證與陰虛證患者基因差異表達圖譜研究

洪朝金1郭 勇2（指導）

1浙江省人民醫(yī)院腫瘤科 杭州 310014 2浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 杭州 310006

目的 研究大腸癌圍手術期氣虛證與陰虛證患者的特征性基因差異表達譜。方法 大腸癌手術患者8例，以圍手術期中醫(yī)辨證，氣虛證4例（氣虛證組），陰虛證4例（陰虛證組），采集8例患者大腸癌組織及瘤周正常組織，采用含有45 033個己知基因的人全基因組芯片技術檢測大腸組織內差異基因表達情況，比較各組的差異表達基因，利用生物分子功能注釋系統(tǒng)GO和pathway對相關基因進行生物信息學分析。結果 大腸癌圍手術期氣虛證瘤體組和瘤周正常組差異表達基因共5044條，表達水平上調3400條,下調1644條；氣虛證瘤體組與陰虛證瘤體組差異表達基因共1335條，表達水平上調547條，下調788條。經檢索互聯(lián)網生物學公共數據庫GeneBank，獲得每條基因的名稱和其他基本信息。結論 大腸癌圍手術期氣虛證組與瘤周正常組比較，存在的組織基因差異表達特征圖譜，主要與細胞凋亡、細胞周期、血管平滑肌收縮、嘌呤嘧啶代謝、細胞信號傳導、DNA復制等基因相關；氣虛證組與陰虛證組瘤體比較，也存在組織基因差異表達特征圖譜，主要是與炎癥、免疫應答、礦物質吸收、細胞內吞、細胞黏附、遺傳信息過程、肌動蛋白細胞骨架的調控、氮代謝、細胞信號傳導等基因相關。

大腸癌圍手術期；氣虛證；陰虛證；基因差異表達；基因芯片

KEY WORDSperioperative period of colorectal carcinoma；Qi deficiency syndrome；Yin deficiency syndrome；genes differently expressed map gene chips

基因組學從整體上研究基因的功能，這與中醫(yī)學的“整體觀”概念十分相似。基因芯片是隨著人類基因組研究的深入而迅速發(fā)展起來的一項重要的生物學技術，它的特點是高通量、快速、并行化采集生物信息。借助基因芯片這種先進、快速的研究手段，可以嘗試從基因水平探討大腸癌圍手術期證候的本質，通過對同病異證基因表達譜差異比較中尋找證候的差異性，建立“證候-基因表達譜”，揭示證與基因的內在聯(lián)系。證候研究是中醫(yī)基礎理論研究的核心內容。筆者對大腸癌圍手術期氣虛證與陰虛證患者的特征性基因差異表達譜進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIZOL試劑 （Invitrogen life technologies）；Invitrogen Superscript雙鏈cDNA合成試劑盒（Invitrogen，11917-020）；NimbleGen單色DNA標記試劑盒；NimbleGen芯片雜交系統(tǒng)(Nimblegen，05223679001）；NimbleGen芯片雜交試劑盒（Nimblegen，05223474001）；NimbleGen HX12 mixer（Nimblegen，05223768001）；NimbleGen洗滌緩沖試劑盒（Nimblegen，05223504001）

1.2 儀器及設備 Rotor-Gene 3000 Realtime PCR儀（Corbett Research公司）；引物設計軟件（Primer 5.0）；Rotor-gene 6.0（Corbett Research公 司）；GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems）；GenePix 4000B（Axon）；GenePix pro V6.0。

1.3 病例來源 2011年8月—2011年10月共收集大腸癌圍手術期患者8例，均來源于浙江大學附屬第一醫(yī)院。其中男4例，女4例，年齡48～68歲；結腸癌4例，直腸癌4例；術前均經腸鏡明確診斷，術后病理證實；氣虛證與陰虛證患者各4例。

1.4 診斷標準 大腸癌診斷標準參照中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范》2011版。臨床分期使用AJCC（2007年版）制定的TNM分期。中醫(yī)辨證標準參照《GB/T 16751.2-1997中醫(yī)臨床診療術語證候部分國家標準（GB）》進行。氣虛證:主證:①氣短乏力；②神疲懶言；③舌淡；④脈虛細無力。次證：①頭暈眼花；②飲食減少；③自汗。具備主證三項、次證一項者即為氣虛證。陰虛證：主證：①五心煩熱；②咽燥口干渴；③舌紅或少苔、無苔；④脈細數。次證:①潮熱；②便結而尿短赤；③盜汗。具備主證三項、次證一項者即為陰虛證。

1.5 納入排除標準 納入標準：①有細胞學或病理學依據；②大腸癌圍手術期；③年齡50～70歲；④調查時能良好配合；⑤中醫(yī)辨證氣虛型或陰虛證。排除標準：①病理診斷不明確；②調查時合并有其他疾病，并以其他疾病為突出表現(xiàn)，影響大腸癌證候辨證者；③合并有嚴重的心、肺、腦、肝、腎、糖尿病等重大疾病者；④不符合納入標準或臨床資料不全者；⑤既往有惡性腫瘤史者；⑥精神病患者以及神志不清，無法語言交流者。

2 方 法

2.1 大腸癌組織采集 經腸鏡下診斷符合納入標準后，經手術室切取4例氣虛證患者大腸癌組織及瘤旁正常組織各1塊，4例陰虛證患者癌組織各1塊。生理鹽水清洗后，氣虛證癌組織、瘤旁正常組織及陰虛證患者癌組織各取一塊置于10%福爾馬林液中備做病理切片HE染色檢查，其余于置于RNAlater中，置凍存管中迅速投入液氮，以防止大腸癌組織內部的RNA降解。備基因芯片研究。

2.2 RNA提取和質量控制 采用Trizol及其方法抽提總RNA，12個組織樣本RNA合并并混勻；采用NanoDrop ND-1000測定 RNA在分光光度計280nm、260nm、230nm的吸收值，以計算濃度并評估純度，用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。樣本的吸光度A260與A280比值在1.95～2.05之間，電泳RNA的28S和18S條帶清晰，28S條帶約是18S條帶的2倍為質量合格。

2.3 熒光標記 以TotalRNA起始，嚴格按照Roche-NimbleGen試劑盒說明書進行，取反轉錄物，以Random Primer為引物進行Klenow酶標記，標記產物用PCR NucleoSpin Extract II Kit（MN）純化。

2.4 雜交與清洗 將標記好的樣品與雜交buffer（3×SSC，0.2%SDS，50×Denhart’s，25%甲酰胺）混勻后，注到已經與相應混合物黏合的芯片上，采用RocheNimbleGen Hybridization System雜交儀42℃雜交16～20h。雜交結束后，去除混合物，分別用洗液I、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ清洗芯片，甩干，掃描。

2.5 芯片掃描、圖像的采集 采用GenePix4000B（Axon）掃描儀掃描芯片的熒光強度，觀察雜交結果；采用Gene Pixpro V6.0軟件對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數字信號。

2.6 芯片數據分析 采用Agilent GeneSpring GX V11.5.1軟件進行數據分析。對所有芯片的Normalized Intensity，F(xiàn)old Change進行分析，取其Normalized Intensity做t檢驗，設定判斷差異基因表達的標準為：Fold-Change＞2.0，P＜0.05為顯著差異表達基因。使用安捷倫的Gene Spring GX軟件（V11.5.1）進行分層聚類。對差異表達基因逐一進行生物信息學分析，檢索互聯(lián)網生物學公共數據庫，如geneontology、GeneBank、KEGG等，進行GO和PATHWAY分析。

3 結 果

3.1 大腸癌組織病理學觀察 病理切片HE染色檢查，顯示大腸癌圍手術期氣虛證患者瘤體組織出現(xiàn)癌細胞的浸潤，瘤周正常組織無癌細胞侵及。見圖1～3（封二）。

3.2 樣本組織總RNA純化及質檢 280nm、260nm、

230nm下的吸光度分別代表核酸、蛋白、鹽濃度的值。通常OD260/OD280（Ratio）應當接近2.0。在1.8～2.1時，認為RNA中蛋白或者其他有機物的污染是可以容忍的，OD/260/230（Ratio）應當大于1.8。經核酸定量分析儀檢測，12例RNA的OD260/OD280在2.0左右，見表1，說明提取的RNA純度較高。

表1 利用NanoDrop ND-1000檢測RNA純度和質量的結果

RNA質量判斷標準：有清晰的28S、18S條帶，無降解，且肉眼觀察28S條帶亮度約是18S的1～2倍。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，由電泳圖可見，RNA電泳條帶清晰可見，無拖尾現(xiàn)象，28S比18S rRNA條帶亮度接近2:1，質量合格，總量夠用，滿足后續(xù)實驗需要。見圖4。

圖4 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

3.3 芯片掃描結果及分析 對第一組芯片如前所設條件進行分析，得出大腸癌圍手術期氣虛證瘤體組和瘤周正常組差異表達基因共5044條，其中，表達水平上調3400條，下調1644條。經檢索互聯(lián)網生物學公共數據庫GeneBank，獲得每條基因的名稱和其他基本信息。主要為與細胞凋亡、細胞周期、谷胱甘肽新陳代謝、DNA修復、蛋白質生物合成、蛋白質運輸、甾體生物合成，細胞信號傳導等相關基因。對第二組芯片如前所設條件進行分析，得出大腸癌氣虛證瘤體組和陰虛證瘤體組差異表達基因共1335條，其中，表達水平上調547條，下調788條。經檢索互聯(lián)網生物學公共數據庫GeneBank，獲得每條基因的名稱和其他基本信息。主要為與炎癥、免疫應答、礦物質吸收、細胞內吞、細胞黏附、遺傳信息過程、肌動蛋白細胞骨架調控、氮代謝、細胞信號傳導等相關基因。陰虛證與氣虛證所涉及炎癥相關主要差異基因表達上調的有：TNF-α，IL-1Ra，IL-2RG，NFYATF2，BCL2L1，DVL3，ELK1，ELK4，F(xiàn)ZD4，JAK3，NFATC1，NFB，RELA，RELB，SLC2A1，WNT5A等。涉及細胞內吞作用（Endocytosis）主要差異基因表達上調的有：DNM1，EPN1，F(xiàn)2R，GRK6，IGF1R，IL-2RG，NEDD4，PIP5K1A，PML，SMAD6。

4 討論

本研究結果顯示，氣虛證與陰虛證差異表達基因主要涉及以下幾類：炎癥，細胞內吞，礦物質吸收，酮體合成與分解，免疫功能，信號傳導通路等。

炎癥是機體對致炎因子的損傷所發(fā)生的一種以防御反應為主的基本病理過程。此過程主要表現(xiàn)為局部組織發(fā)生變質（變性、壞死）、滲出（血管反應、液體和細胞滲出）和增生改變，臨床上有紅、腫、熱、痛和功能障礙，而全身則常伴有不同程度的發(fā)熱、白細胞增多、代謝增強等。局部發(fā)生的一系列變化，有利于局限、消滅致炎因子和清除壞死組織，促進局部修復，對機體是有利的。但是，并不是所有炎癥對機體都是有利的，有時也會給機體帶來危害。本研究中氣虛證與陰虛證涉及相關主要差異基因表達上調的有16條：炎癥主要差異表達基因有：TNF-α，IL-1Ra，IL-2RG，NFYATF2，BCL2L1，DVL3，ELK1，ELK4，F(xiàn)ZD4，JAK3，NFATC1，NFB，RELA，RELB，SLC2A1，WNT5A等。

腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）主要由活化單核巨噬細胞產生，又稱惡液質素，活化T淋巴細胞也可產生一種與TNF-α類似的（有30%左右的同源性）淋巴毒素，并與TNF-α有共同的受體，稱之為TNF-β。TNF-α基因位于第6號染色體短臂的主要組織相容性復合體（MHC）內，與TNF-β基因緊密連鎖，存在于C2與HLA-B基因之間。人的TNF-α根據種屬及分離方法不同，可以二聚體、三聚體和五聚體的形式存在。人的TNF-α為非糖基化蛋白，而幾乎所有動物的TNF-α均為糖蛋白。小鼠和人的TNF-α分別由其前體分子在N端脫去76和79個氨基酸而成[1]。

腫瘤壞死因子是一種具有多種生物功能的促炎細胞因子。它可以活化內皮細胞促進黏附分子的表達，參與炎癥細胞的募集，還可以通過調節(jié)其它炎癥因子的表達從而影響炎癥反應的程度[2]。

IL-1Ra也是一類重要的抗炎性細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1Ra可以抑制IL-l與IL-1R結合，起到抗炎癥作用。IL-1Ra能抑制PGE生成，下調Cox-2和膠原酶-1的表達，減輕白細胞浸潤[3]。IL-1Ra可以抑制脂多糖（LPS）刺激的單核巨噬細胞釋放TNF-1α和IL-lβ[4]，IL-1Ra能夠與IL-1R結合，但不能啟動相應的信號轉導。且IL-1Ra可以與IL-l競爭結合IL-1R，從而阻斷IL-lα/β介導的信號轉導，降低IL-1的生物學活性[5]。申維璽等[6-9]運用分子生物學的理論和方法進行研究，提出了陰虛證的本質可能是白細胞介素1（IL-1）、腫瘤壞死因子（TNF）等細胞因子表達發(fā)生改變；陰虛證的基本發(fā)病學機制是由于機體在各種致陰虛證病因的損害作用下，IL-1、TNF等炎性細胞因子群的基因表達水平相對增強、生物學活性相對升高，引起細胞因子網絡紊亂和功能態(tài)平衡失調的結果。陰虛證時，機體免疫力降低，IL-1Ra基因表達下調，IL-1Ra產生減少，不能有效抑制IL-1與IL-1R結合，導致陰虛證時炎性細胞因子IL-1等的活性增強。

陰虛證與氣虛證涉及細胞內吞作用（endocytosis）主要差異基因表達上調的有10條：DNM1，EPN1， F2R，GRK6，IGF1R，IL2RG，NEDD4，PIP5K1A，PML，SMAD6。

細胞通過胞吐作用將細胞內的物質運送到細胞外，又通過內吞作用將細胞外的營養(yǎng)物質等攝取到細胞內以維持正常的代謝活動。細胞的內吞有兩種類型，一種是吞噬細胞完成的對有害物質的吞噬，另一種類型是通過細胞質膜受體介導的對細胞外營養(yǎng)物質的內吞。賴梅生等[10]利用具有養(yǎng)陰功效的滋陰清熱方治療SLE陰虛證，治療前高表達的基因IL-2R，治療后明顯下降，提示IL-2R基因高表達可能與陰虛證相關，滋養(yǎng)清熱方作用機制可能是通過影響IL-2R表達，進而影響細胞的內吞作用。

本研究亦顯示，與氣虛證相比，陰虛證中與細胞內吞作用的相關基因IL-2等表達明顯增加，提示氣虛證與陰虛證可能在有關影響細胞內吞作用的基因中存在差異。

本研究結果提示，大腸癌圍手術期氣虛證與陰虛證存在有組織差異表達基因組學背景，發(fā)現(xiàn)的一批大腸癌圍手術期氣虛證瘤體組與陰虛證瘤體組差異基因，可以進一步從功能基因組學的角度對其調控網絡進行分析和蛋白表達等方面進行深入研究，并進而推廣至其他主要證候，尋找新型證候標志物，從而作為大腸癌中醫(yī)辨證論治的實驗依據，并為建立科學評價大腸癌的中醫(yī)藥療效指標奠定基礎?？梢詮牟煌C候基因表達譜的差異，探尋“證”的基因表達譜，進一步研究出“證”的基因芯片；同時，建立不同“證”的基因芯片，將中醫(yī)的“證”制成具有基因表達水平定性和定量作用的表達譜芯片，使診斷趨向規(guī)范化；使辨證結論達到最佳化，確立治則和選方用藥個體化，從而實現(xiàn)中醫(yī)證的臨床診斷治療的現(xiàn)代化。

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Comparison of Differently Expressed Genes Between Patients with Qi Deficiency and Yin Deficiency in Perioper-ative Period of Colorectal Carcinoma

HONG Chaojin1,GUO yong2(advisor).1.Department of Oncology,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou(310014),China;2.First Clinical Medicine School of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective Comparison of differently expressed genes between patients with Qi deficiency and Yin deficiency in perioperative period of colorectal carcinoma.Methods Eight patients with colon carcinoma undergone colectomy were divided into two groups according to the differential diagnosis with TCM syndrome during the perioperative period:Qi deficiency group（n=4）and Yin deficiency group（n=4）.The tumor tissue and corresponding non-tumor normal tissues were collected for detection of gene expression by human gene technology with 45 033 known human genes.The gene chip images of two groups were analyzed by Pathway and GO system.Results A total of 5044 genes expressed differently in colorectal tissue and corresponding non-tumor normal tissue in Qi deficiency group,among which 3400 were up-regulated and 1644 were down-regulated;the expression of 1335 genes were different between Qi deficiency group and Yin deficiency group,among which the expression was elevated in 547 genes and was decreased in 788 genes.After retrieving the public databank,the names and basic information of all these differently expressed genes were obtained.Conclusion Comparing tumor tissue with corresponding non-tumor normal tissue in Qi deficiency group,the differently expressed gene map included apoptosis,cell cycle, vascular smooth muscle contraction,purine and pyrimidine metabolism,signaling pathway,and DNA replication.The difference in gene expression between Qi deficiency and Yin deficiency group included inflammation,immune response,mineral absorption,endocytosis,cell adhesion,genetic information pathway,regulation of actin cytoskeleton, nitrogen metabolism,signaling pathway.

2014-05-28

修回日期：2014-07-14

浙江省中醫(yī)藥科技計劃重大項目（No.2007ZA007）

郭勇，Tel：13588887292