蔡鵬飛，劉明華，馮林林，劉俊紅，尤朝菲，章卓（瀘州醫(yī)學(xué)院:科技處；藥學(xué)院藥理教研室；中藥學(xué)本科00級，四川瀘州646000）

Aβ1-42誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡最適濃度與時(shí)間選擇*

蔡鵬飛，劉明華1，馮林林2，劉俊紅2，尤朝菲2，章卓1
（瀘州醫(yī)學(xué)院:科技處；1藥學(xué)院藥理教研室；2中藥學(xué)本科2010級，四川瀘州646000）

目的:探討β樣淀粉肽1-42（Aβ1-42）誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC）細(xì)胞凋亡的最適濃度和時(shí)間。方法:體外培養(yǎng)HUVEC，將Aβ1-42分為5×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1、5、5×10、5×102μmol/L 7個(gè)濃度，分別刺激0.5、2、6、12、24、48 h后，采用CCK-8法觀察細(xì)胞活力，熒光顯微鏡觀察Hochest33342/PI雙染后細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果：同陰性組比較，Aβ1-42濃度≥5μmol/L刺激48 h均可引起細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.05）。5×10，5×102μmol/L刺激24 h可引起HUVEC細(xì)胞活力下降，但48h HUVEC細(xì)胞活力下降更明顯（P＜0.05）。Hochest33342/PI雙染可見明顯核濃縮和凋亡小體的產(chǎn)生，甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。結(jié)論:Aβ1-42刺激后引起HUVEC細(xì)胞活力下降呈時(shí)間與劑量依賴性，綜合時(shí)間與劑量考慮，5×10μmol/L刺激24h可致理想的HUVEC細(xì)胞凋亡模型。

β樣淀粉肽1-42；HUVEC細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)異常沉積、細(xì)胞凋亡在阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)的發(fā)病中起著重要作用，β-淀粉樣蛋白由39～43個(gè)氨基酸組成，聚集態(tài)的Aβ1-42可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，損傷神經(jīng)細(xì)胞[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆于血管內(nèi)壁，構(gòu)成血管通透性的主要屏障，有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)血管舒張、止血和趨化白細(xì)胞的作用[2]。β-淀粉樣蛋白致阿爾茨海默病病人血管內(nèi)皮產(chǎn)生炎癥、凋亡在AD的發(fā)病中越來越受到重視[3]，因此深入探索β-淀粉樣蛋白致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與凋亡規(guī)律，尋找保護(hù)內(nèi)皮的措施有重要意義。目前雖然有學(xué)者對Aβ1-42致人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelialcells,HUVEC）凋亡有少量研究，但是尚未對Aβ1-42引起HUVEC凋亡的最適時(shí)間和劑量進(jìn)行研究，故本研究通過對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞施以不同濃度Aβ1-42處理，檢測在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率，分析不同濃度Aβ1-42誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的差異，為深入研究阿爾茨海默病血管內(nèi)皮損傷的發(fā)病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

Aβ1-42（北京奧普森有限公司）；HUVEC細(xì)胞（瀘州醫(yī)學(xué)院功能性食品與藥品研究中心惠贈(zèng)）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Keygen公司，批號20101202）；Hoechst 33342以及PI（Sigma，USA）；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清（hyclone，USA）；CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.1.2 儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-1F型）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司，CKX41型）；CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司，MCO-15AC型）；離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠，LG10-3A型）；酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，DNM-9602型）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司，SBK-YLQX-003552型）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測HUVEC細(xì)胞活性

將Aβ1-42溶于超凈水，配成500μmol/L母液分裝，-20℃凍存，使用前于37℃孵育1周，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)。HUVEC細(xì)胞株培養(yǎng)液為RPMI1640+10%胎牛血清+青鏈霉素，5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4 d傳代1次。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。

取對數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞，0.25%胰酶制成單個(gè)細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×105/L接種于96孔板，每孔90μl，培養(yǎng)24h待其貼壁后加藥。每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，Aβ1-42組（Aβ1-42+細(xì)胞）分為5×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1、5、5×10、5×102μmol/L7個(gè)濃度，陰性組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）加等體積RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為0.5、2、6、12、24、48h，之后每孔加入CCK-810μl繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值，以O(shè)D值反應(yīng)細(xì)胞活力情況，連續(xù)重復(fù)3次。

1.2.2 Hochest33342/PI雙染檢測HUVEC細(xì)胞凋亡

HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.1，根據(jù)1.2.1結(jié)果，選擇Aβ1-425、5×10、5×102μmol/L處理24 h后Hochest33342/PI雙染檢測HUVEC細(xì)胞凋亡。收集細(xì)胞懸浮于1ml培養(yǎng)基中，加入10μl Hochest 33342儲存液(100mg/L，蒸餾水溶解)，染色15min；將細(xì)胞置于冰上冷卻后，離心，去上清，將細(xì)胞重懸于1m lPBS中，加人5μlPI儲存液(1g/L，蒸餾水溶解)，混勻，熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，組間均值比較采用SNK法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件分析處理。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Aβ1-42在不同處理時(shí)間對HUVEC細(xì)胞活力影響

不同濃度Aβ1-42處理0.5 h與2 h對HUVEC細(xì)胞活性沒有明顯影響，與陰性組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；5×102μmol/LAβ1-42在處理6、12、24、48h后抑制HUVEC細(xì)胞活性，同陰性組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中48 h同陰性對照組比較有顯著意義（P＜0.01）；5×10μmol/LAβ1-42在處理24h,48h后抑制HUVEC細(xì)胞活性，同陰性組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；5μmol/LAβ1-42處理48h抑制HUVEC細(xì)胞活性，同陰性對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1μmol/LAβ1-42在各時(shí)間段對HUVEC細(xì)胞活性無明顯影響（P＞0.05），見圖1。

圖1 Aβ1-42不同濃度和不同處理時(shí)間對HUVEC細(xì)胞活力影響

2.2 不同濃度Aβ1-42誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài)變化

Hochest33342/PI雙染顯示，陰性對照組細(xì)胞形態(tài)呈圓形，淡藍(lán)色，無凋亡細(xì)胞。Aβ1-425、5×10、5×102μmol/L三組細(xì)胞均可見部分呈凋亡特征性改變，細(xì)胞核呈亮藍(lán)色染色，隨濃度增加凋亡細(xì)胞較多，還可見死亡細(xì)胞（紅色），見圖2。

圖2 不同濃度Aβ1-42刺激HUVEC細(xì)胞24 h后凋亡影響(×200)

3 討論

阿爾茨海默病患者由于神經(jīng)元營養(yǎng)的缺乏、缺氧、代謝物堆積、Aβ1-42沉積等出現(xiàn)血管內(nèi)皮的損傷，Aβ1-42在毛細(xì)血管的沉積不僅造成毛細(xì)血管的閉塞，并可引起腦血流量的失調(diào)。用Aβ1-42損傷原代培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以造成內(nèi)皮細(xì)胞連接遭到破壞，細(xì)胞連接蛋白受到損傷，毛細(xì)血管發(fā)生了變性和退化，失去了原來的形狀[4-5]。Aβ1-42致HUVEC細(xì)胞凋亡可部分模擬阿爾茨海默病的血管內(nèi)皮損傷，但是對于Aβ1-42刺激的時(shí)間與濃度卻因?qū)嶒?yàn)室不同而存在差異，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诤Y選出Aβ1-42刺激HUVEC細(xì)胞建立損傷凋亡模型的最適濃度和時(shí)間。

在本實(shí)驗(yàn)中，選擇了Aβ1-425×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1、5、5×10、5×102μmol/L 7個(gè)濃度及0.5、2、6、12、24、48 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨濃度增加和處理時(shí)間的延長，對HUVEC細(xì)胞活性影響較大。所有劑量在處理0.5h與2h后幾乎對HUVEC細(xì)胞活性沒有影響；5μmol/L處理48h可使HUVEC細(xì)胞活性受到影響。5×10μmol/L處理時(shí)間更短一些，24h可抑制HUVEC細(xì)胞生長；5×102μmol/L處理6 h即可抑制HUVEC細(xì)胞生長。從上述結(jié)果中我們可以看出，Aβ1-425×102μmol/L造模效果最佳，但劑量明顯偏大，適合處理時(shí)間較短，經(jīng)濟(jì)充裕的實(shí)驗(yàn)；Aβ1-425×10μmol/L與5μmol/L較為合適，因此可以從經(jīng)濟(jì)和時(shí)間角度上可以考慮Aβ1-425×10μmol/L刺激24 h造?；蛘?μmol/L刺激48 h。從Hochest 33342/PI雙染結(jié)果顯示，Aβ1-425、5×10、5×102μmol/L刺激24 h后即可見部分呈凋亡特征性改變，5×10、5×102μmol/L凋亡細(xì)胞更多，5×102μmol/L則死亡細(xì)胞較多。

綜上，Aβ1-42刺激后引起HUVEC細(xì)胞活力下降呈時(shí)間與劑量依賴性，本實(shí)驗(yàn)綜合凋亡結(jié)果、經(jīng)濟(jì)性、時(shí)間等多種因素認(rèn)為，Aβ1-425×10μmol/L刺激24h是致HUVEC細(xì)胞凋亡的理想劑量和時(shí)間。

1.Ma JF,W ang HM,LiQY,etal.Starvation triggersAbeta42 generation from humanumbilicalvascularendothelialcells[J]. FEBSLett，2010，584(14):3101～3106.

2.Yu H,Yang M,W ang Y,etal.p75NTR ismainly responsible for Aβtoxicity but not for its internalization:a primary study[J].NeurolSci,2012,33(5):1043～1050.

3.Belyaev ND,NalivaevaNN,Makova NZ,etal.Neprilysin gene expression requires binding of the amyloid precursor protein intracellular domain to itspromoter:implications for Alzheimerdisease[J].EMBO Rep,2009,10(1):94～100.

4.Thal DR,Capetillo-Zarate E,Larionov S,et al.Capillary cerebralamyloid angiopathy isassociated w ith vessel occlusionand cerebralblood flow disturbances[J].NeurobiolAging,2009,30(12):1936～1948.

5.SoniaM arco,Stephen D.Skaper Am yloid-peptide l-42 alters tight junction protein distribution and expression in brain m icrovessel endothelial cells[J].Neuroscience Letters，2006,401:219～224.

（2013-9-26收稿）

Screen of theoptim alconcentration and incubution tim eofAβ1-42in inducingapoptosisofHUVEC cell

CaiPengfei,LiuMinghua1,Feng Linlin2,Liu JunHong2,You Caofei2,Zhang Zhuo1
Department of Science and Technology;1Department of Pharmacology；2Undergraduate of Luzhou Medical CollegeChineseMateriaMedicaClass2010,LuzhouMedicalCollege

Objective：To screen the optimal concentration and incubation time ofβ-amyloid 1-42 in inducing apoptosis of Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).Methods：HUVEC were cultivated in vitro.β-amyloid 1-42 was diluted into 5×10-4，5×10-3，5×10-2，5×10-1，5，5×10，5×102μmol/L；the incubation time was set at 0.5，2，6，12，24 and 48 h.The cell viability was observed by CCK-8 and the cell morphology was observed by fluorescencemicroscopy after dyeing with Hochest33342/PI.Resu lts:Compared with negative control group,cell viability of all the groups with Aβ1-42≥5μmol/L after stimulating 48 hours was decreased significantly（P＜0.05).The viability of HUVEC incubated with 5×10 and 5×102μmol/Lβ-amyloid 1-42 for 24 hours or 48 hourswas decreased significantly（P＜0.05）.The nuclear enrichmentand apoptotic body could be observed by Hochest33342/PI.Conc lusion:HUVEC cell viability decreased in a time and dose related way after incubated withβ-amyloid1-42.Considering of the time and dose comprehensively, incubation with 5×10μmol/Lβ-amyloid 1-42 for 24 hours can establish the idealmodel ofHUVEC apoptosis.

β-amyloid 1-42；HUVEC；Apoptosis

R967

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2014.02.012

*四川省教育廳課題（102c099）；瀘州市科技局課題（2012s36）作者簡介:蔡鵬飛(1981-)，男，講師，E-mail:35989298@qq.com

章卓（1979-），男，副教授，E-mail:zhhuozhang-100@163.com