肖興莉，楊朝鮮，高小青，陳秀（瀘州醫(yī)學(xué)院:附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；神經(jīng)生物教研室，四川瀘州646000）

海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法

肖興莉，楊朝鮮1，高小青1，陳秀
（瀘州醫(yī)學(xué)院:附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；1神經(jīng)生物教研室，四川瀘州646000）

目的:掌握海馬神經(jīng)元的有效培養(yǎng)方法和細(xì)胞保存培養(yǎng)方法，利于細(xì)胞模型的建立。方法:取出出生1 d的SD大鼠海馬，聯(lián)合機(jī)械吹打法和胰酶消化法分離海馬細(xì)胞，加入DMEM/F12+10%FBS制備細(xì)胞懸液，接種在玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)1～2 d，收集上清細(xì)胞液、離心、重懸細(xì)胞；再接種在培養(yǎng)板上，培養(yǎng)1 d后，全液更換為Neurobasal+2%B27,以后每3 d半量換液。利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；利用NF-200、Neu-N抗體免疫熒光、免疫組化技術(shù)鑒定海馬神經(jīng)元；利用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)孔海馬細(xì)胞比例；利用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。結(jié)果:接種在培養(yǎng)板上第1 d細(xì)胞貼壁，第3～4 d細(xì)胞長(zhǎng)出突觸，第7～8 d細(xì)胞突觸生長(zhǎng)迅速，第11～13 d細(xì)胞交織成網(wǎng)狀，第15～20 d細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，20 d后細(xì)胞形態(tài)開始改變。免疫熒光技術(shù)鑒定細(xì)胞突觸呈紅色，細(xì)胞核呈綠色；免疫組化技術(shù)鑒定突觸和胞核都呈棕黃色。細(xì)胞純度95～97.5%，細(xì)胞活性以15～17 d最高（93.94～95.13%），與其他時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.01。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便可行，節(jié)約取材及時(shí)間，可獲得純度高、活性好的海馬細(xì)胞，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

海馬神經(jīng)元；原代培養(yǎng)；細(xì)胞保存培養(yǎng)

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)之一，參與內(nèi)臟活動(dòng)和情緒活動(dòng)的調(diào)節(jié)，以及個(gè)人保存和種族保存的維持，同時(shí)與學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)密切相關(guān)，特別是近期記憶。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)形成的特殊結(jié)構(gòu)[1]。近來研究證明，海馬結(jié)構(gòu)早期變化參與Alzheimer'sdisease(阿爾茨海默病，AD)、海馬硬化癥、癡呆等相關(guān)神經(jīng)元退行性疾病的病理生理過程[2]。正是由于海馬結(jié)構(gòu)和功能的重要性，對(duì)于它的研究較多，但是在細(xì)胞水平和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面的研究較少，本實(shí)驗(yàn)提供了一較好的細(xì)胞模型基礎(chǔ)，為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和器材

大鼠抗NF-200單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗Neu-N單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司；胰蛋白酶購自Sigma公司；B27 Serum-Frrsupplement購自Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司；多聚-D-賴氨酸（poly-D-lysine）購自Sigma公司；Neurobasal培養(yǎng)液購自Gibco公司；Goatanti-rabbit IgG(H+L)FITC conjugated購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋；抗熒光淬滅封片液（強(qiáng)）購自碧云天生物技術(shù)研究所；MTT購自Sigma公司；青霉素-鏈霉素購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶若干。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生24h的SD大鼠2只，購自瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

1.2.1 主要試劑的配置

①細(xì)胞爬片液的配置：用購自Sigma公司的poly-D-lysine原液分裝，以1∶10的比例用0.01mol/L的PBS液配置，4°C保存?zhèn)溆?；②FBS的滅活：FBS用10m l的離心管分裝備用，-20°C保存。用前先在37°C溶解，再在55°C～60°C下滅活30min；③細(xì)胞種植液和無血清培養(yǎng)液的配置：DMEM/F12+10% FBS+1%青霉素-鏈霉素；Neurobasal+2%B27+1%青霉素-鏈霉素；4°C保存?zhèn)溆?；④一抗和二抗的配置：NF-200、Neu-N、Goatanti-rabbit IgG(H+L)FITC conjugated、羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠IgG分別用0.01 mol/L的PBS稀釋至1∶300、1∶100，一抗-20°C保存?zhèn)溆茫欢宫F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 細(xì)胞爬片的制備

選擇與培養(yǎng)板大小合適的蓋玻片，清洗、泡酸過夜、消毒、烘干。分別放入培養(yǎng)板內(nèi)，每個(gè)蓋玻片上滴一滴爬片液、鋪勻、37°C孵箱孵育過夜；次日吸出多余的爬片液，用無菌蒸餾水沖洗3遍，讓其自然風(fēng)干，至少4h，備用[3]。

1.2.3 取材

①消毒：用新生SD大鼠2只，先用酒精浸泡1 min，再用碘伏消毒；②固定、暴露、定位：左手固定頭部，新生鼠頭腹曲，首先用無菌眼科剪把皮膚和顱骨剪開，向前翻；暴露出全部大腦，在其中后1/3的地方輕輕剝離出像月牙狀的對(duì)稱海馬組織（見圖1）；③清洗：放入盛有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，剝離腦膜，清洗組織；④剪切、機(jī)械吹打、消化：干凈后放入無菌的干燥培養(yǎng)皿內(nèi)，用眼科剪剪碎成稀糊狀，再吸入裝有組織體積4倍的DMEM/F12培養(yǎng)液的離心管內(nèi)，用吸管吹打50次左右，靜置5min后，吸取上清液，剩下的沉淀再按照相同的比例加入DMEM/F12，再加入等體積的0.25%的胰酶，在常溫下，邊吹打邊觀察，液體變得均勻混濁后加入等體積的FBS終止消化。最后配平，1100 r/min離心，收集細(xì)胞沉淀。以上都要在冰上操作。

圖1 分離出的新鮮海馬組織

1.2.4 細(xì)胞懸液的制備和接種

收集的細(xì)胞加入細(xì)胞體積3倍的種植液，吹打混勻，用2%臺(tái)盼藍(lán)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)板粗略檢測(cè)活細(xì)胞濃度，接種在50ml的玻璃培養(yǎng)瓶中。

1.2.5 細(xì)胞差速貼壁

細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶1～2 d后，收集上清液、1100 r/min離心、收集細(xì)胞。同樣加入細(xì)胞體積3倍的種植液，吹打混勻，用2%臺(tái)盼藍(lán)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)板粗略檢測(cè)活細(xì)胞濃度，1×104～1×105個(gè)/L接種300μl的細(xì)胞懸液在多聚賴氨酸包被好的24孔培養(yǎng)板上。培養(yǎng)1 d后，全量更換種植液為無血清培養(yǎng)液，此后每3 d半量換液，每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.2.6 細(xì)胞保存培養(yǎng)

對(duì)于一次取材太多，為減少取材的次數(shù)，不讓細(xì)胞浪費(fèi)，可把培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞在第一次收集后，又重懸細(xì)胞懸液，接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，繼續(xù)貼壁生長(zhǎng)，4 d左右又可收集細(xì)胞懸液，繼續(xù)前方法，把貼壁的細(xì)胞用胰酶消化收集、離心、重懸、接種在培養(yǎng)板上，如上方法培養(yǎng)。

1.2.7 細(xì)胞的鑒定

對(duì)生長(zhǎng)成熟的海馬神經(jīng)元去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定細(xì)胞、0.3%Tritonx-100打孔、0.3%H2O2去除過氧化物酶、山羊血清封閉非特異性抗體、一抗NF-200、Neu-N 4°C過夜、熒光二抗閉光室溫孵育1 h、免疫熒光檢測(cè)。

1.2.8 細(xì)胞純度檢測(cè)

細(xì)胞純度計(jì)算：利用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，一個(gè)孔表示一個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)孔海馬神經(jīng)元的比例：每個(gè)孔海馬神經(jīng)元總數(shù)/每個(gè)孔細(xì)胞總數(shù)×100%，依次得到96個(gè)值；采用Excel繪圖，直觀的看出神經(jīng)元的純度百分比分布情況。

1.2.9 活性檢測(cè)

采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。細(xì)胞懸液接種在96孔板上，培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的海馬細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液后，每個(gè)孔加入100～200μl 10%的MTT，培養(yǎng)4 h輕吸去MTT后加入等量的DMSO，在恒溫水浴振蕩器中震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定吸光度值（同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照，即：未加入細(xì)胞）[3]。計(jì)算方法：細(xì)胞生存率=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度值× 100%；重復(fù)10次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，利用x±s計(jì)量分析。各組間比較采用單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行兩兩比較。按照α=0.05的水準(zhǔn)判斷是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察（如圖2）

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)變化

2.2 NF-200、Neu-N免疫熒光鑒定和免疫組化鑒定(圖3)

圖3 海馬神經(jīng)元NF-200、Neu-N鑒定

2.3 細(xì)胞純度檢測(cè)

通過倒置相差顯微鏡觀察96孔板成熟海馬神經(jīng)元（胞體圓、折光性強(qiáng)、立體感強(qiáng)、突起粗大），計(jì)算海馬神經(jīng)元的細(xì)胞純度(圖4)。

圖4 SD大鼠海馬細(xì)胞純度頻次分布

2.4 細(xì)胞活性情況

海馬神經(jīng)元在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞生存率不同，從1～15 d海馬神經(jīng)元生存率逐漸升高；15～17 d大概在平臺(tái)期，以后細(xì)胞生存率降低，迅速凋亡見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元活性情況

3 討論

海馬是大腦的重要結(jié)構(gòu)之一，體積小、功能多樣、位置隱蔽、分層復(fù)雜，包含有古皮層（3層）和新皮層（6層），主要有椎體細(xì)胞和細(xì)顆粒細(xì)胞組成，參與大腦邊緣系統(tǒng)構(gòu)成，在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域?qū)τ谠撓到y(tǒng)的研究仍是熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一[1]。神經(jīng)系統(tǒng)的任務(wù)是接收、發(fā)放、處理、存儲(chǔ)和提取信息，這些任務(wù)都是通過其基本單位——神經(jīng)細(xì)胞來完成。海馬神經(jīng)元就是重要的神經(jīng)元之一[4]。由于神經(jīng)元是形態(tài)各異、功能復(fù)雜、化學(xué)性遞質(zhì)繁多的特化細(xì)胞，這就決定了神經(jīng)元培養(yǎng)的特殊性。由于海馬組織由神經(jīng)元和非神經(jīng)元構(gòu)成，取材的部位不能完全準(zhǔn)確這些原因都會(huì)影響神經(jīng)元的純度。除此之外，海馬細(xì)胞原代培養(yǎng)還有取材來源和培養(yǎng)調(diào)節(jié)苛刻、步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)等情況。Neurobasal培養(yǎng)基是一種能滿足新生和成體腦神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)的特殊基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，B27是一種神經(jīng)元生長(zhǎng)及維持的添加劑，能夠代替血清中的某些成分，故聯(lián)合使用能提高神經(jīng)元的純度和活性。本實(shí)驗(yàn)利用成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元貼壁快的原理，即差速貼壁法，能有效的提高神經(jīng)元的純度。同時(shí)利用玻璃培養(yǎng)瓶聯(lián)合培養(yǎng)板培養(yǎng)，即細(xì)胞的保存培養(yǎng)：在一次取材多時(shí)，可以先讓細(xì)胞在玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)備用，從而解決一次取材少但又要多次取材的難題。

NF-200是神經(jīng)纖維絲的一種，主要表達(dá)在胞漿和突觸，參加構(gòu)成神經(jīng)細(xì)胞的骨架。Neu-N是一種特有的神經(jīng)元DNA結(jié)合蛋白，分子質(zhì)量46～48 kDa，它的功能還不是很清楚，但Soylemezoglu等研究證實(shí)：它是神經(jīng)系統(tǒng)專有的細(xì)胞核調(diào)節(jié)分子之一[5]，它們都是海馬神經(jīng)元特有的結(jié)構(gòu)成分。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合免疫熒光、免疫組化方法對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞核、軸突的鑒定，更具有說服力。

大部分的研究集中在動(dòng)物組織層面，對(duì)于細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究尚少。細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量直接影響到研究的進(jìn)展，也將影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。為此，本實(shí)驗(yàn)就提供了一種穩(wěn)定、簡(jiǎn)單、細(xì)胞純度和活性較高的細(xì)胞培養(yǎng)方法，為后續(xù)研究提供細(xì)胞基礎(chǔ)。

1.李云慶.Basic Neuroscience[M].北京:高等教育出版社，2010，260～261.

2.Cheng Y，Yu Lc.Galanin Protects Am yloid-β-Induced neurotoxicity on primary cultured hippocampal neurons of rats[J].Journalof Alzheimer'sDisease,2010，10:1143～1157.

3.D.L.斯佩克特,R.D.戈德曼.CellA LaboratoryManual[M].北京:科學(xué)出版社2001,953～954.

4.鄭志竑，林玲.神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng):理論與實(shí)踐[M].北京:科學(xué)出版社，2002,4～29.

5.GillSK，IshakM，RyleteRJ，etal.Exposureofnuclearantigens in form alinfixed,paraffin embedded necropsy human spinal cord tissue:Detection of NeuN[J].Journal of NeuroscienceMethods,2005,148:26～35.

（2013-06-28收稿）

Primary culturemethod of hippocam pal neurons

Xiao Xingli,Yang Chaoxian1，Gao Xiaoqing1，Chen Xiu1
Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College；1Department of Neurological Biology,Luzhou Medical College

Ob jective：To establish an effective culturemethod of hippocampalneuronsand preservable cells for the establishimentof cellmodels.Methods：SD rathippocampal neruons(born 1 day)were isolated bymechanical blow and pancreatic enzyme digestion.DMEM/F12+10%FBSsuspended hippocampalneuronswere inoculated on the glassculture vessels(1～2 days).The upper cellsuspensionwas collected，centrifugated，resuspended and inoculated on orifice plates forone day.Themedium was replaced by Neurobasal+2%B27 every 3 days.Inverted phase contrast microscopewasused toobservecellmorphologicalchangse.Hippocampusneuronalidentificationand cellactivitywere detected with immunocytochemistry and MTT.Resu lts:Hippocampal neuronswere adherent to orifice plates on the firstday.Thecellsynapsesgrew on the3th～4th day.Thecellsynapses reticulateon the11th～13th day.Thecellsgrew especially strongon the 15th～20th day and after the20th day therewas cellapoptosis.The cellsynapsewas red and nucleuswas green thatwas identified with immunofluorescent staining.The cell synapse and nucleuswere brownish yellowwith immunohistochemistry.Theneruon puritywas95%～97.5%.Thecellactivitywas thehighestin the15th～17th day（93.94%～95.13%）compared with other time growps（P＜0.01）.Conclusion:Our culturemethod is economical and can save a lot of time with simplicility and feasibity.The high purity and activity of hippocampal neuronsprovide theexperimentalbasisfor furtherstudy.

Hippocampalneurons；Primary culture；Preservablecellculture

R741

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2014.02.014

肖興莉（1987-），女，住院醫(yī)師，碩士生，E-mail:245964222@qq.com