(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣東湛江524001)

腔隙性腦梗死(LI)是腦卒中最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，盡管病變面積不大，也會(huì)造成嚴(yán)重功能障礙，如血管性癡呆等［1］。微小RNA(miRNA)參與調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的形成，而AS是常見(jiàn)腦血管病的共同病理基礎(chǔ)［2，3］。研究證明，miR-146a 在人 AS 斑塊中顯著上調(diào)［3］，其多態(tài)性已被證實(shí)與多種疾病的發(fā)生相關(guān)［5～7］，但與LI的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。2011年2月 ～2012年 9月，我們探討了 miR-146a rs2910164和rs57095329位點(diǎn)的基因多態(tài)性與LI的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入患者均符合全國(guó)第四屆腦血管病會(huì)議修訂的LI診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT/MRI證實(shí)，梗死灶直徑＜15mm;排除房顫、血液病、結(jié)核、惡性腫瘤、大動(dòng)脈炎、周?chē)芗膊』蛑車(chē)芩ㄈ约膊〖皣?yán)重肝腎功能不全者。選擇廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診并符合上述標(biāo)準(zhǔn)的患者173例(觀察組)，與觀察組性別、年齡匹配的非心腦血管疾病門(mén)診體檢者298例(對(duì)照組)。觀察組男118例、女55例，年齡(69.89±9.78)歲;對(duì)照組男 192 例、女 106 例，年齡(69.58±8.72)歲。

1.2 方法

1.2.1 miR-146a基因型檢測(cè) 采用SNaPshot法。采集空腹靜脈血0.5 mL，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA。選擇miR-146a的多態(tài)位點(diǎn)rs2910164和rs57095329［5，7］，采用 Primer3.0 軟件設(shè)計(jì)合成引物，rs2910164上游引物:5'-AACTGAATTCCATGGGTTG-3'，下游引物:5'-CACGATGACAGAGATATCCC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度:232 bp;rs57095329上游引物:5'-TCATTGGGCAGCCGATAAAG-3'，下游引物:5'-AGGAAGTTCTGGTCAGGCG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度:318 bp。PCR 反應(yīng)體系為 20 μL:10 ×HotStarTaq buffer 2.0 μL，3.0 mm Mg2+4.0 μL，上、下游引物各20 pmol，0.3 mm dNTP 0.5 mmol，1 U HotStarTaq DNA Polymerase 1.0 U，樣本 DNA 0.2～0.5 μg及滅菌去離子水適量。擴(kuò)增條件:95℃ 2 min;94℃ 20 s，65℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共11個(gè)循環(huán);94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72℃ 90 s，共24個(gè)循環(huán);72℃ 2 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，上樣于ABI3130XL測(cè)序儀中，使用GeneMapperV4.1軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2 頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(CIMT)檢測(cè) 采用B型彩色多普勒超聲儀，探頭頻率為10 MHz。分別測(cè)量患者兩側(cè)頸總動(dòng)脈前后壁的CIMT，取其平均值。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-146a基因多態(tài)性比較 兩組miR-146a rs2910164和rs57095329位點(diǎn)的基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡，表明該基因型分布在所研究的人群中已達(dá)到了遺傳平衡，可以進(jìn)行候選基因的關(guān)聯(lián)分析。兩組miR-146a基因多態(tài)性比較，見(jiàn)表1。

2.2 兩組不同性別、年齡miR-146a基因多態(tài)性比較 見(jiàn)表2。

表1 兩組m iR-146a基因的基因型和等位基因頻率比較［例(%)］

表2 兩組不同性別、年齡m iR-146a基因型和等位基因頻率比較［例(%)］

2.3 觀察組miR-146a正常和突變基因型患者的CIMT比較 觀察組miR-146a rs2910164位點(diǎn)CC、CG+GG基因型患者的 CIMT分別為(0.128±0.028)、(0.137±0.051)cm，miR-146a rs57095329 位點(diǎn) AA、AG+GG基因型患者的 CIMT分別為(0.134±0.046)、(0.131 ±0.035)cm，P 均 ＞0.05。

3 討論

近年來(lái)LI發(fā)病率持續(xù)升高，顱內(nèi)穿支AS被認(rèn)為是LI的重要病因［8］。據(jù)推測(cè)，人類(lèi)基因組上約有1/3的基因受到miRNA的調(diào)控，其調(diào)節(jié)紊亂可導(dǎo)致多種病理過(guò)程［9］。miR-146a通過(guò)TLR介導(dǎo)的信號(hào)通路參與細(xì)胞的天然免疫，調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答、腫瘤發(fā)展及抗病毒免疫［8，10］;靶向 CD40L來(lái)調(diào)節(jié)炎癥性細(xì)胞因子的分泌和成熟過(guò)程［11］;靶向TLR4抑制ox-LDL誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累和炎癥應(yīng)答［12］。miR-146a在人AS斑塊中顯著上調(diào)［3］，并能促進(jìn) Th1細(xì)胞的分化［13，14］。miR-146a 前體中 rs2910164 的多態(tài)性已被證實(shí)與肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌等疾病相關(guān)［5～7，10］，而 rs57095329 位點(diǎn)也被證實(shí)能影響miR-146a的成熟，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感性相關(guān)［7］。

本研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶rs2910164位點(diǎn)GG基因型或G等位基因的人群，其患LI的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，原因可能是rs2910164位點(diǎn)的C/G變異影響了前體miR-146a的成熟和 miR-146a的表達(dá)，使得 miR-146a在AS中的作用被削弱。本研究還發(fā)現(xiàn)，兩組不同性別者miR-146a rs2910164和rs57095329位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率無(wú)顯著差異，而攜帶miR-146a rs2910164位點(diǎn)G等位基因70歲以下者患LI的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。最近一項(xiàng)韓國(guó)的研究認(rèn)為，miR-146a rs2910164位點(diǎn)的G等位基因在缺血性腦卒中起致病作用［15］;而 Liu 等［16］在中國(guó)漢族人群中的研究認(rèn)為，miR-146a rs2910164多態(tài)與缺血性腦卒中的發(fā)病無(wú)關(guān)。以上均與本研究中 miR-146a rs2910164的G等位基因可能是LI保護(hù)性因素的觀點(diǎn)相悖，可能與種族差異、入組標(biāo)準(zhǔn)、試驗(yàn)方法及其他環(huán)境因素等對(duì)結(jié)果的影響有關(guān)。

CIMT是AS早期表現(xiàn)形式的一種，大量研究證實(shí)，CIMT升高與AS進(jìn)展及腦梗死的發(fā)病相關(guān)。因此，CIMT被認(rèn)為是腦梗死的強(qiáng)效預(yù)測(cè)因子。本研究結(jié)果顯示，miR-146a rs2910164和rs57095329的基因突變對(duì)LI患者CIMT的影響無(wú)顯著性差異，這可能與miR-146a基因在AS早期對(duì)CIMT的影響不明顯有關(guān)。

綜上所述，LI患者miR-146a基因rs2910164位點(diǎn)G等位基因頻率降低，G等位基因可能是其發(fā)病的一種保護(hù)性因素。未來(lái)的研究中，我們?nèi)孕钄U(kuò)大樣本進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步對(duì)miR-146a基因多態(tài)性對(duì)LI發(fā)病的影響及作用機(jī)制進(jìn)行探討。

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