于廣洋，孫 巖，齊 燦，顧興洲，楊小清，韓瑞發(fā)

(1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211;2天津市泌尿外科研究所;3天津市泌尿外科基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點實驗室)

腎細胞癌(RCC)是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2% ～3%［1，2］。腎透明細胞癌(ccRCC)是 RCC 最常見類型，占全部 RCC的 80%［2］。直結(jié)腸癌缺失基因(DCC)由Sato等［3］首先確定并命名，是當前發(fā)現(xiàn)的最長的人類抑癌基因。近年來發(fā)現(xiàn)，DCC不僅在結(jié)腸腫瘤中表達缺陷，在胰腺、卵巢、子宮、乳腺、血液系統(tǒng)等多種腫瘤中表達減少或缺失，且與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4～9］。本研究觀察 DCC在ccRCC組織中的表達，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2006年6月～2008年6月具有完整臨床及隨訪資料的ccRCC患者術(shù)后常規(guī)石蠟包埋標本132例，均進行Fuhrman分級及2009年AJCC的TNM分期，均由2名病理科醫(yī)師確診，術(shù)前、術(shù)后均未接受放療、化療、免疫治療或靶向治療。同時取距離病灶2 cm以上的癌旁組織作為對照。

1.2 方法

1.2.1 DCC檢測 采用免疫組化SP法。步驟嚴格按說明書進行。每例連續(xù)切片5張，厚5μm;切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇逐步水化后，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)進行微波抗原修復(fù)20 min;3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，避光靜置20 min;滴加DCC一抗，4℃孵育過夜;取出后37℃復(fù)溫30 min;滴加 HRP標記聚合物，37℃孵育20 min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染細胞核。以PBS緩沖液為一抗作為陰性對照。DCC抗體為鼠抗人單克隆抗體，購于英國Abcam公司。

1.2.2 免疫組化染色結(jié)果判定 DCC蛋白主要定位于細胞膜、細胞質(zhì)，以細胞膜、細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色均質(zhì)染色為陽性，細胞不染色或與間質(zhì)背景一致為陰性。隨機選擇5個視野(×400)，根據(jù)著色細胞數(shù)的比例判定反應(yīng)強度:陽性細胞＜10%為－，10% ～60%為+，＞60%為++，+、++均記作陽性［10］。

1.2.3 隨訪方法 采用電話及書信方式對患者進行隨訪，總體生存時間定義為術(shù)后至死亡或隨訪終點的時間。隨訪截止日期為2013年6月。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件。DCC在ccRCC與癌旁正常腎組織間表達差異，及其與臨床病理因素的關(guān)聯(lián)性檢測，采用χ2或Fisher精確性檢驗方法。采用Kaplan－Meier法繪制DCC陽性與陰性ccRCC患者的生存曲線，采用Log－rank檢驗比較DCC陽性與陰性ccRCC患者總生存率。采用COX回歸進行單因素及多因素分析，判斷影響ccRCC患者預(yù)后的獨立影響因素。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DCC表達情況 DCC在ccRCC組織和癌旁正常組織中的陽性表達率分別為39.39%(52/132)、100%(132/132)，P ＜0.05。見插頁Ⅲ圖7。

圖7 ccRCC組織及癌旁正常組織中DCC免疫組化染色圖片（×400）

2.2 DCC表達與ccRCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系DCC表達與ccRCC組織中TNM分期、病理分級、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及大血管浸潤相關(guān)(P均＜0.05);與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)(P 均 ＞0.05)。見表1。

表1 ccRCC組織中DCC表達與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

2.3 生存分析結(jié)果 隨訪時間12～84個月，中位時間60個月。隨訪期間，44例(33.33%)死亡。Log－rank顯示DCC陽性及陰性ccRCC患者的總生存率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011)。見圖1。

2.4 單因素及多因素分析結(jié)果 DCC表達情況、TNM分期、病理分級、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及大血管浸潤是ccRCC預(yù)后的獨立影響因子，P均＜0.05。見表2。

3 討論

圖1 DCC陽性及陰性ccRCC患者的生存曲線

表2 ccRCC影響因子的COX單因素及多因素分析

DCC定位于18q21.3，有29個外顯子、28個內(nèi)含子，現(xiàn)已明確DCC基因含轉(zhuǎn)錄起始部位、信號肽基因及編碼跨膜蛋白的基因位點。DCC蛋白為跨膜蛋白，主要由細胞質(zhì)內(nèi)(325個氨基酸)和細胞質(zhì)外(1100個氨基酸)兩部分組成，細胞膜外多肽的氨基酸順序和神經(jīng)細胞黏附分子(NCAM)及相關(guān)的細胞表面糖蛋白相似，具有同源性［11］。NCAM可以通過介導(dǎo)細胞之間、細胞與基質(zhì)之間的相互作用，影響細胞生長、分化、信號傳遞等［12］。Chan 等［13］報道，DCC蛋白具有與神經(jīng)生長因子1(Netrin－1)直接結(jié)合的活性，并能發(fā)揮受體作用，提示DCC蛋白是Nertin－1受體。Netrin受體處于開放(on)狀態(tài)，即與配體結(jié)合時，傳遞積極的信號促進細胞增殖、分化、遷移等;處在關(guān)閉(off)狀態(tài)，即未與配體結(jié)合時，則促進細胞的凋亡。因此，無論處在開放還是關(guān)閉狀態(tài)，Netrin－1受體都有活躍的生物學(xué)行為。Mehlen等［14］研究表明，在配體 Netrin－1 存在的環(huán)境中，DCC蛋白具有抗細胞凋亡的功能;但配體缺乏時(例如轉(zhuǎn)移狀態(tài))，DCC蛋白可作為腫瘤抑制蛋白，發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。這說明DCC蛋白可能是一種腫瘤轉(zhuǎn)移或局部浸潤性生長的抑制因子，而DCC功能的喪失可以增加配體缺乏環(huán)境中的細胞生存。Tanaka等［15］將含正常DCC基因的18q導(dǎo)入結(jié)腸癌細胞株CoKFU和SW480(兩種細胞株中DCC基因表達均明顯減少，且有1個等位基因丟失)中，發(fā)現(xiàn)上述細胞恢復(fù)表達DCC蛋白，并且腫瘤細胞在體外環(huán)境下的生長速度及在裸鼠體內(nèi)的致瘤能力受到抑制。近期研究發(fā)現(xiàn)，DCC基因低表達、表達缺失等現(xiàn)象出現(xiàn)在胰腺、卵巢、子宮、乳腺、前列腺、血液系統(tǒng)等多種腫瘤中，與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4～9］。由此可見，DCC基因缺失或失活是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個促發(fā)因素。

ccRCC的發(fā)生、進展與復(fù)雜的染色體改變不斷積累密切相關(guān)。目前為止，關(guān)于DCC基因在ccRCC組織標本中的研究并不多，并且標本例數(shù)較少。Hirata等［16］研究了126例RCC患者基因18q的雜合性缺失(LOH)，其中 LOH 最高頻率(13.5%)發(fā)生在18q21.3。因此，位于18q21.3的DCC和SMAD4作為候選基因，可能影響RCC的發(fā)生、發(fā)展。Dekel等［17］應(yīng)用免疫組化法對94例RCC標本進行檢測，并隨訪了相應(yīng)患者;結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨訪期間RCC死亡患者中DCC蛋白低表達率為63%，而術(shù)后無瘤生存患者中只有36%為DCC蛋白低表達。因此，DCC蛋白低表達可能與RCC腫瘤侵襲性、病死率密切相關(guān)［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)，ccRCC組織中DCC陽性表達低于癌旁正常組織;DCC表達與ccRCC的TNM分期、病理分級、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及大血管浸潤相關(guān);DCC陽性和陰性ccRCC患者生存率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;DCC表達、TNM分期、腫瘤分級、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及大血管浸潤是ccRCC預(yù)后的獨立影響因子;提示DCC基因缺失或失活是ccRCC發(fā)生、發(fā)展的一個促發(fā)因素，檢測 DCC表達對ccRCC早期診斷、治療和預(yù)后評估有重要意義，其有可能成為一種新的分子標記物，為ccRCC靶向治療等提供理論基礎(chǔ)。

［1］Yao M，Huang Y，Shioi K，etal.Expression of adipose differentiation－related protein:a predictor of cancer－specific survival in clear cell renal carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2007，13(1):152－60.

［2］趙振威，李延江.腎細胞癌流行病學(xué)的研究進展［J］.山東醫(yī)藥，2013，53(7):95－97.

［3］Sato K，Tamura G，Tsuchiya T，et al.Frequent loss of expression without sequence mutations of the DCC gene in primary gastric cancer［J］.Br JCancer，2001，85(2):199－203.

［4］Mille F，Llambi F，Guix C，etal.Interfering withmultimerization of netrin－1 receptors triggers tumor cell death［J］.Cell Death Differ，2009，16(10):1344－1351.

［5］Bamias A，Yu Z，Weinberger PM，et al.Automated quantitative analysis of DCC tumor suppressor protein in ovarian cancer tissue microarray shows association with beta－catenin levels and outcome in patientswith epithelial ovarian cancer［J］.Ann Oncol，2006，17(12):1797－1802.

［6］李會明，李佩玲，莊如錦，等.DCC基因與婦科腫瘤研究新進展［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2007，15(11):128－130.

［7］Hadziavdic＇V，Pavlovic＇－Calic＇N，Eminovic＇I.Microsatellite instability and lossof heterozygosity of tumor suppressor genes in Bosnian patientswith sporadic colorectal cancer［J］.Bosn JBasic Med Sci，2008，8(4):313－321.

［8］Koren R，Dekel Y，Sherman E，etal.The expression of DCC protein in female breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2003，80(2):215－220.

［9］Henríquez－Hernández LA，Valenciano A，F(xiàn)oro－Arnalot P，et al.Polymorphisms in DNA－repair genes in a cohort of prostate cancer patients from different areas in Spain:heterogeneity between populations as a confounding factor in association studies［J］.PLoS One，2013，8(7):e69735.

［10］吳文溪，馬利民.大腸癌中DCC基因表達缺失及其臨床意義［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2002，7(6):405－407.

［11］Barberá VM，Martín M，Mari?oso L，et al.The 18q21 region in colorectal and pancreatic cancer:independent loss of DCC and DPC4 expression ［J］.Biochim Biophys Acta，2000，1502(2):283－296.

［12］Fazeli A，Dickinson SL，Hermiston ML，et al.Phenotype ofmice lacking functional Deleted in colorectal cancer(Dcc)gene［J］.Nature，1997，386(6627):796－804.

［13］Chan SS，Zheng H，Su MW，et al.UNC－40，elegans homolog of DCC(Deleted in Colorectal Cancer)，is required in motile cells responding to UNC－6 netrin cues［J］.Cell，1996，87(2):187－195.

［14］Mehlen P，F(xiàn)earon ER.Role of the dependence receptor DCC in colorectal cancer pathogenesis［J］.JClin Oncol，2004，22(16):3240－3248.

［15］Tanaka K，Oshimura M，Kikuchi R，etal.Suppression of tumorigenicity in human colon carcinoma cells by introduction of normal chromosome 5 or 18［J］.Nature，1991，349(6307):340－342.

［16］Hirata H，Matsuyama H，Matsumoto H，etal.Deletionmapping of 18q in conventional renal cell carcinoma［J］.Cancer Genet Cytogenet，2005，163(2):101－105.

［17］Dekel Y，Kugel V，Livne PM，etal.DCC protein expression in clear cell renal cell carcinoma［J］.BJU Int，2004，93(6):867－869.

［18］趙振威，李延江，俞亮.腎細胞癌1 068例臨床分析［J］.山東醫(yī)藥，2013，53(12):50－51.