樊梓鸞 ， 林秀芳 ， 王 麗 ， 王振宇 ，

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150090）

懸鉤子（Rubus kamanowii），俗稱(chēng)樹(shù)莓，是薔薇科（Rosacea）懸鉤子屬（Rubus）的一種落葉漿果類(lèi)灌木，也是一種新興經(jīng)濟(jì)林木品種。樹(shù)莓果實(shí)為聚合漿果，柔嫩多汁，色澤宜人，風(fēng)味獨(dú)特。除鮮食外，還可生產(chǎn)果醬、果汁、果酒、果凍、軟糖等，為天然保健食品[1]。樹(shù)莓果營(yíng)養(yǎng)豐富，含有比現(xiàn)有栽培水果及其它任何野果都高的維生素E、SOD、氨基丁酸等抗衰老物質(zhì)[2]。特別是鞣化酸、花青素含量豐富，對(duì)結(jié)腸、宮頸、乳腺、肝和胰腺癌有一定的預(yù)防作用和療效。在醫(yī)藥、化妝、保健食品等方面有著廣泛的用途[3-4]。

高速剪切技術(shù) （High-speed Shear Dispersing Emulsifier，HSDE）是近幾年新興的提取技術(shù)，是樣品在高剪切分散乳化機(jī)上，接受轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的高剪切線速度和高頻機(jī)械效應(yīng)帶來(lái)的強(qiáng)勁動(dòng)能，使物料在定、轉(zhuǎn)子狹窄的間隙中受到強(qiáng)烈的機(jī)械效應(yīng)、剪切效應(yīng)和氣蝕作用的協(xié)同作用。Hua[5]等運(yùn)用高速剪切技術(shù)提取黃芪中類(lèi)黃酮，探討了提取動(dòng)力學(xué)模型，結(jié)果顯示此方法明顯優(yōu)于超聲波提取技術(shù)。孫術(shù)國(guó)[6]等運(yùn)用高速剪切與微波輔助偶聯(lián)技術(shù)提取鮮葛中葛根素，與傳統(tǒng)方法相比具有提取率高、時(shí)間短、能耗小等優(yōu)點(diǎn)。

由于多酚類(lèi)活性物質(zhì)不穩(wěn)定，用傳統(tǒng)方法提取一般提取時(shí)間較長(zhǎng)，溫度較高，特別是超聲波輔助提取在提取過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，這些自由基會(huì)與活性成分中用于清除自由基的集團(tuán)結(jié)合，從而降低了提取物的抗氧化活性。為了解決以上問(wèn)題，選取高剪切分散乳化技術(shù)提取懸鉤子多酚，考察提取溶劑濃度、高剪機(jī)轉(zhuǎn)速、剪切時(shí)間3個(gè)工藝參數(shù)，采用響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化，應(yīng)用 Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合[7-8]，探索高剪切分散乳化提取懸鉤子多酚的優(yōu)化工藝條件，以期最大限度的保持懸鉤子有效成分被提取出來(lái)，同時(shí)不破壞其活性，為懸鉤子多酚產(chǎn)業(yè)化提取提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

懸鉤子 （Rubus kamarowii Nakai.）2012年 8月采摘于伊春，速凍冷藏保存。

1.2 儀器與設(shè)備

SHB循環(huán)水多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；JJ-2型組織粉碎機(jī)：常州儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；FA25高剪切分散乳化機(jī)：上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司產(chǎn)品；722可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；721紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；DF204電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京西城區(qū)醫(yī)療器械二廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多酚活性成分的提取 取100 g速凍冷藏的懸鉤子漿果，加入200 mL預(yù)冷凍丙酮溶液，先用組織粉碎機(jī)勻漿3 min，然后轉(zhuǎn)入高剪切分散乳化機(jī)均質(zhì)，最后抽濾，收集濾液，適當(dāng)稀釋后進(jìn)行吸光度測(cè)定。

1.3.2 多酚多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 采用福林-酚法[9]，分別取125 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或稀釋樣品，加入125 μL FCR混合靜置6 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%Na2CO3（1.25 mL），用水調(diào)至 3 mL（加水 1.5 mL），放置 90 min，760 nm測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 高剪切分散乳化技術(shù)提取懸鉤子多酚的單因素實(shí)驗(yàn) 分別以不同提取溶劑的濃度、高剪切轉(zhuǎn)速、剪切時(shí)間為單因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各單因素對(duì)提取得到多酚含量的影響，每個(gè)單因素水平重復(fù)3次測(cè)其吸光值。

1.3.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化冷凍均質(zhì)輔助提取多酚的工藝參數(shù) 經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)確定了不同提取溶劑的濃度、高剪切轉(zhuǎn)速、剪切時(shí)間為主要影響因素，運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件程序根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析法，以多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值作響應(yīng)面，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 高剪切分散乳化技術(shù)提取懸鉤子多酚的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溶劑濃度對(duì)總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 如圖1可以看出，丙酮體積分?jǐn)?shù)在50%~80%時(shí)，增加趨勢(shì)較明顯，在體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到696.4 mg/hg鮮果，比體積分?jǐn)?shù)50%時(shí)增加了96.1 mg/hg鮮果，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)80%以后，隨溶液體積分?jǐn)?shù)增加，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，這是因?yàn)槎喾宇?lèi)物質(zhì)的復(fù)雜性，有些物質(zhì)易溶于水 （如黃酮苷類(lèi)等），而有些物質(zhì)易溶于有機(jī)溶劑（如黃酮苷元等），當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，可最大量的溶出有機(jī)溶劑溶出物以及水溶物。

圖1 溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effect of extraction solvent concentration on polyphenol content

2.1.2 高剪切轉(zhuǎn)速對(duì)總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 如圖2所示，高剪切轉(zhuǎn)速在10 000~16 000 r/min時(shí)，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加，高剪切轉(zhuǎn)速為16 000 r/min時(shí)，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為693.4 mg/hg鮮果，比10 000 r/min的增加了83.9 mg/hg鮮果，隨著功率增大，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，這是因?yàn)楣β试酱螅羟辛υ酱?，破壞了多酚?lèi)物質(zhì)（如黃酮母核）的結(jié)構(gòu)，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

2.1.3 高剪切時(shí)間對(duì)總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 如圖3所示，剪切時(shí)間在0~1 min時(shí)，增加趨勢(shì)較明顯，增加了111.2 mg/hg鮮果，在2~5 min時(shí)，變化趨勢(shì)平緩，在3 min時(shí)，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到695.9 mg/hg鮮果。這是因?yàn)楦咿D(zhuǎn)速剪切可以有效的破壞植物細(xì)胞壁，使活性物質(zhì)充分溶于溶液中，但隨剪切時(shí)間越長(zhǎng)，與氧氣接觸時(shí)間越多，酚酸可能被氧化成醌，從而多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

圖2 剪切轉(zhuǎn)速對(duì)總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of HSDE rotary speed on polyphenol content

圖3 剪切時(shí)間對(duì)總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect of treatment time on polyphenol content

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化懸鉤子多酚的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析法因素水平的選擇 根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取溶液濃度、高剪切轉(zhuǎn)速、和剪切時(shí)間3個(gè)因素，進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（取中心點(diǎn)為 3），利用 Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表 1。

表1 相應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels in the response surface design

2.2.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 以提取溶液濃度（X1）、高剪切轉(zhuǎn)速（X2）、剪切時(shí)間（X3）為自變量，總多酚含量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

2.2.3 方差分析結(jié)果 通過(guò)Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果回歸擬合后所得的模擬方程為：Y=687.51+44.29X1+39.43X2+37.96X3-18.24X1X2+12.19X1X3+1.17X2X3-32.36X12-37.84X22-66.09X32。其決定系數(shù) R2=0.978 8，表明該回歸模型的擬合情況較好，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值比較接近，模型的可靠性可通過(guò)方差分析及相關(guān)系數(shù)來(lái)考察（見(jiàn)表 3）。

從方差分析結(jié)果可知，模型在 P≤0.01水平時(shí)差異顯著，因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.978 8），說(shuō)明該模型能夠較好地描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，信躁比為=15.576＞4說(shuō)明用此模型可以得到足夠強(qiáng)的相應(yīng)信號(hào)。因此可以用模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)懸鉤子多酚提取工藝結(jié)果。從表3中可以看出，X1、X2、X3、X12、X22、X326 項(xiàng)為極顯著影響因素，X1X2項(xiàng)為顯著響因素。通過(guò)對(duì)Y的回歸系數(shù)的檢驗(yàn)可知，各因素對(duì)多酚含量提取影響的大小順序?yàn)椋禾崛∪芤簼舛龋╔1）＞ 均質(zhì)轉(zhuǎn)速（X2）＞ 均質(zhì)時(shí)間（X3）。

2.2.4 響應(yīng)面與等高線 響應(yīng)面的圖形是響應(yīng)值對(duì)各實(shí)驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，根據(jù)擬合函數(shù)，每2個(gè)因素對(duì)提取得率畫(huà)出響應(yīng)面和等高線圖，此時(shí)考慮到定性分析各因素對(duì)多酚提取量的關(guān)系，固定另外 2個(gè)因素時(shí)，均作“0”水平處理。圖4～6為各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖。從圖中可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，找出最佳工藝參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用，從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值，響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等高線中的最小橢圓的中心點(diǎn)。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for response quadratic model

圖4 Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面與等高線Fig.4 Responsive surfaces and contours of Y=f（X1，X2）

將建立的回歸模型中的任一因素固定在零水平，得到另外兩個(gè)因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖4~6所示。隨著每個(gè)因素的增大，響應(yīng)值增大；當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減?。槐容^3組圖可知，對(duì)多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響顯著的因素，表現(xiàn)為曲線較陡；對(duì)多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響次顯著或不顯著的因素，表現(xiàn)為曲線較為平滑，隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。在交互項(xiàng)對(duì)多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響中，提取溶液的濃度與高剪機(jī)轉(zhuǎn)速 （X1X2）對(duì)多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響較顯著。圖4在X1與X2交互作用等高線中，沿A軸向等高線變化密集，而B(niǎo)軸向等高線變化相對(duì)稀疏，說(shuō)明A（X1）對(duì)響應(yīng)值峰值的影響比B（X2）大；圖6，在X2與X3交互作用等高線中，等高線密度沿 B（X2）軸方向略大于 C（X3）軸方向，說(shuō)明 B（X2）和 C（X3）的交互作用中，高剪機(jī)轉(zhuǎn)速對(duì)響應(yīng)值峰值的影響大于剪切時(shí)間。

圖5 Y=f（X1，X3）的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Responsive surfaces and contours of Y=f（X1，X3）

圖6 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面與等高線Fig.6 Responsive surfaces and contours of Y=f（X2，X3）

2.2.5 提取工藝條件的確定 為進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)，利用design-expert 7.0.0軟件對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，可得懸鉤子多酚提取的最佳條件為：提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)：86.45%，高剪機(jī)轉(zhuǎn)速：18 218 r/min，剪切時(shí)間：221.98 s，預(yù)測(cè)多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)能達(dá)到715.76 mg/hg。為檢驗(yàn)該法的可靠性，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝參數(shù)修正為：丙酮體積分?jǐn)?shù)：85%，均質(zhì)機(jī)功率：18 000 r/min，均質(zhì)時(shí)間：220 s。進(jìn)行懸鉤子活性物質(zhì)提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)， 實(shí)際含量分別為 712.54、719.64、709.49 mg/hg，實(shí)際得率平均值為（713.89±0.66）mg/hg，可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，說(shuō)明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)懸鉤子提取物中總多酚的含量。根據(jù)此優(yōu)化條件，測(cè)定懸鉤子的總黃酮和花色苷的含量[10]分別為（229.97±1.37）mg/hg鮮果和（28.75±0.43）mg/hg鮮果。

3 結(jié)語(yǔ)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了冷凍均質(zhì)提取懸鉤子活性物質(zhì)的工藝，建立了多元回歸模型，模型擬合度良好。由Design-Expert7.0.0軟件分析確定了懸鉤子多酚的最佳提取條件，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝參數(shù)修正為：丙酮體積分?jǐn)?shù)：85%，均質(zhì)機(jī)功率：18 000 r/min，均質(zhì)時(shí)間：220 s。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得懸鉤子多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)713.89 mg/hg，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，說(shuō)明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)懸鉤子提取物中總多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在最優(yōu)條件下提取的懸鉤子提取物中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為229.997 mg/hg，花色苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.751 mg/hg鮮果。為下一步功能性試驗(yàn)奠定良好的基礎(chǔ)。此方法工藝簡(jiǎn)單，提取出的有效成分含量較高，采用冷凍均質(zhì)提取可有效縮短提取時(shí)間，防止有效成分損失，可用于各種漿果類(lèi)提取有效成分的研究。

[1]韓加，劉繼文.懸鉤子屬植物生物學(xué)作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源，2009，28（2）：1-8.HAN Jia，LIU Jiwen.Advances in the biological effects of plant Rubus[J].Chinese Wild Plant Resources，2009，28 （2）：1-8.（in Chinese）

[2]Wang S Y，Chen C T，Wang C Y.The influence of light and maturity on fruit quality and flavonoid content of red raspberries[J].Food Chemistry，2009，112（3）：676-684.

[3]Fan Z L， Wang Z Y， Zuo L L.Protective effect of anthocyanins from lingonberry on radiation-induced damages[J].International Journal of Environmental Research and Public Health，2012，9（12）：4732-4743.

[4]Szajdek A， Borowska E J.Bioactive Compounds and Health-Promoting Properties of Berry Fruits：A Review[J].Plant Foods for Human Nutrition，2008，63（4）：147-156

[5]Hua J N，F(xiàn)eng Z F，Liu Y F，et al.Extraction kinetics research of flavonoids from Radix astragali based on high shear dispersing emulsifier[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry，2012，40（5）：752-756.

[6]許繼華.基于高剪切分散乳化技術(shù)的黃芪中黃酮類(lèi)化合物提取方法及動(dòng)力學(xué)研究[J].河北醫(yī)藥，2013，35（7）：1090-1092.XU Jihua.Extraction kinetics research of flavonoids from radix astragali based on high shear dispersing emulsifier[J].Hebei Medical Journal，2013，35（7）：1090-1092.（in Chinese）

[7]崔春蘭，鄭虎哲，顧立眾，等.響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化蘋(píng)果渣中多酚類(lèi)物質(zhì)的果膠酶輔助提取工藝[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29（9）：2235-2240.CUI Chunlan，ZHENG Huzhe，GU Lizhong，et al.Optimization of pectinase aided polyphenol extraction from apple pomace by response surface methodology[J].Modern Food Science and Technology，2013，29（9）：2235-2240.（in Chinese）

[8]Tian S Q，Wang Z Y，F(xiàn)an Z L，Zuo L L.Optimization of CO2laser-based pretreatment of corn stover using response surface methodology[J].Bioresource Technology，2011，102（22）：104930-104937.

[9]Fan Z L，Wang Z Y，Liu J R.Cold-field fruit extracts exert different antioxidant and antiproliferative activities in vitro[J].Food Chem，2011，129（2）：402-407.

[10]Zuo L L，Wang Z Y，F(xiàn)an Z L，et al.Evaluation of antioxidant and antiproliferative properties of three actinidia （Actinidia kolomikta， Actinidia arguta， Actinidia chinensis）extracts in Vitro[J].International Journal of Molecular Sciences，2012，13（5）：5506-5518.