張 妹， 過(guò)世東

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

鈣是人體的重要組成物質(zhì)，是人體中所含各種有機(jī)和無(wú)機(jī)元素排行第五大元素，鈣在人體內(nèi)幾乎參與了所有的生命活動(dòng)。最新的科學(xué)研究表明，人體之所以衰老或者發(fā)生疾病，與鈣的代謝發(fā)生紊亂，使細(xì)胞內(nèi)外的鈣濃度發(fā)生變化密切相關(guān)。近年來(lái)，越來(lái)越多人注意補(bǔ)鈣的問(wèn)題。理想的鈣劑應(yīng)具備鈣含量高、吸收效率高、無(wú)副作用、服用方便、口感好等特點(diǎn)，若含有人體所需要的多種氨基酸、維生素及微量元素等物質(zhì)則更為理想。

目前市場(chǎng)上補(bǔ)鈣產(chǎn)品吸收率差別不是很大，一般在20%~40%[1]。目前國(guó)內(nèi)外補(bǔ)鈣制劑繁多，但無(wú)機(jī)鈣鹽占主導(dǎo)地位，無(wú)機(jī)鈣鹽價(jià)格便宜但吸收率低易在腎臟停留，導(dǎo)致腎結(jié)石等疾病，如碳酸鈣長(zhǎng)期服用可能產(chǎn)生大便干燥、食欲不振、胃疼等副作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)補(bǔ)鈣制劑的研究集中在有機(jī)鈣方面，但有機(jī)鈣鹽也存在不同的毒副作用，如乳酸鈣長(zhǎng)期服用容易產(chǎn)生疲勞；葡萄糖酸鈣能引起糖尿病患者血糖升高；醋酸鈣能引起腹瀉等[2-4]。新型可溶性有機(jī)鈣，氨基酸鈣為代表，其特點(diǎn)是：穩(wěn)定性好，易吸收；量小高效；長(zhǎng)期服用無(wú)毒副作用，人體在攝人氨基酸螯合物時(shí)，同時(shí)攝入了一般食物中往往缺乏的2種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)—微量元素和氨基酸，具有雙重營(yíng)養(yǎng)作用在微量攝入時(shí)，氨基酸鈣中鈣的吸收不是以離子形式而是以整個(gè)螯合物形式被吸收的，是一種較為理想的鈣制劑。作者以魚(yú)蛋白酶解液與骨粉鈣制備螯合鈣，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出較佳的螯合條件，為開(kāi)發(fā)魚(yú)類(lèi)下腳料增加其附加值提供參考，為開(kāi)發(fā)鈣營(yíng)養(yǎng)添加劑的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

魚(yú)下腳料：廣西百洋集團(tuán)提供；鈣離子溶液、魚(yú)蛋白水解液：自制；酸性蛋白酶：無(wú)錫銳陽(yáng)生物有限公司產(chǎn)品；無(wú)水乙醇，鹽酸、氫氧化鈉均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器和設(shè)備

萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；超微粉碎機(jī)：桓臺(tái)東奇粉體有限公司產(chǎn)品；DSHZ-300水浴恒溫振蕩器：江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)：美國(guó)熱電公司產(chǎn)品；原子吸光光譜儀：東芝株式會(huì)社產(chǎn)品；傅里葉變換紅外光譜儀：美國(guó)賽默飛公司產(chǎn)品；DL-5離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 骨鈣溶出工藝流程 魚(yú)骨→干燥→粗粉碎→超微粉碎→鹽酸酸解→離心分離→過(guò)濾→游離鈣溶液

1.3.2 螯合工藝流程 酶解液、游離鈣→調(diào)節(jié)pH、溫度、時(shí)間、質(zhì)量比→攪拌螯合→一定體積比的無(wú)水乙醇→離心去上清液→干燥→粉碎→產(chǎn)品

1.4 指標(biāo)的測(cè)定方法

水解度：電位滴定法；鈣的測(cè)定：原子吸光光度計(jì)；螯合物的定性：紅外光譜法。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物的鑒定

取1~2 mg干燥的氨基酸多肽樣品和干燥的螯合鈣產(chǎn)物分別與干燥的KBr（A R級(jí)）粉末（質(zhì)量約樣品的50倍）在瑪瑙研缽中研磨成混合細(xì)粉末。裝入模具內(nèi)，在壓片機(jī)壓制成片測(cè)試，得紅外光譜分析圖 1，圖 2。

圖1 氨基酸多肽的紅外光譜圖Fig.1 Infrared Spectrum of Multi-peptide amino acid

圖2 氨基酸多肽螯合鈣的紅外光譜圖Fig.2 Infrared Spectrum of Chelated Products

紅外光譜整個(gè)范圍可分為4 000~1 300 cm-1與1 300~600 cm-1兩個(gè)區(qū)域。4 000~1 300 cm-1區(qū)域的峰是由伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收帶。由于基團(tuán)的特吸收峰一般位于此高頻范圍，并且在該區(qū)域內(nèi)，吸收峰比較稀疏，因此它是基團(tuán)鑒定工作最有價(jià)值的區(qū)域，稱(chēng)為官能團(tuán)區(qū)。在1 300~600 cm-1區(qū)域中，除單鍵的伸縮振動(dòng)外，還有因變形振動(dòng)產(chǎn)生的復(fù)雜光譜，當(dāng)分子結(jié)構(gòu)稍有不同時(shí)，該區(qū)的吸收就要細(xì)微的差異。這種情況就像每個(gè)人的都有不同的指紋一樣，因而稱(chēng)為指紋區(qū)。

由氨基酸多肽溶液的紅外光譜圖1與螯合產(chǎn)物的紅外光譜圖2可見(jiàn)，在特征區(qū)，—NH2的吸收峰由3 417.81 cm-1移動(dòng)到3 424.04 cm-1：C=O的吸收峰由2 959.87~2 928.83 cm-1移動(dòng)到 2 360.23~2 342.33 cm-1，由兩圖對(duì)比可見(jiàn)，氨基與羧基氧都參與了反應(yīng)，與鈣離子形成配位（p-π）螯合物，證明了螯合鈣的生成。

2.2 游離鈣制備

將魚(yú)骨清洗，去脂，自然風(fēng)干，粗粉碎過(guò)篩，得100目骨粉，超微粉碎5 min。選擇時(shí)間、溫度、骨粉質(zhì)量/鹽酸體積比、鹽酸濃度4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)并方差分析，結(jié)果如表1。

根據(jù)表1，可以得出骨鈣溶出最佳組合是A1B3C3D3， 因素影響順序：B＞A＞D＞C。 用最佳組合A1B3C3D3，得到骨鈣溶出率為74.7%。因此，骨鈣溶出工藝條件是：溫度50℃、時(shí)間100 min、鹽酸濃度4 mol/L、鹽酸量12 mL/g骨粉。

2.3 螯合單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響 在溫度為60℃，氨基酸多肽∶離子鈣的質(zhì)量比為2∶1，螯合時(shí)間為60 min，乙醇體積比 7∶1，選取 pH 值 3、4、5、6、7、8、9 做梯度試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.3 Influence of pH value on Chelate Ratio

由圖3可以看出，在pH值為3到5時(shí)螯合率不斷升高，在pH值5到9呈下降趨勢(shì)。分析原因?yàn)楫?dāng)H+大量存在時(shí)，H+將會(huì)與Ca+爭(zhēng)奪供電子基團(tuán)，不利于螯合物的生成，當(dāng)pH超過(guò)6以后，OH-與供電子基團(tuán)爭(zhēng)奪Ca+優(yōu)先結(jié)合生成氫氧化鈣沉淀，故pH選擇在5左右為適宜。

2.3.2 螯合溫度對(duì)螯合反應(yīng)的影響 在氨基酸多肽∶離子鈣的質(zhì)量比為2∶1，螯合時(shí)間為60 min，pH值 4， 乙醇體積比 7∶1， 選取 30、40、50、60、70、80、90、95℃，做梯度試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 螯合溫度對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.4 Influence of Temperature on Chelate Ratio

由圖4可以看出，溫度低于90℃螯合率緩慢上升，而高于90℃時(shí)螯合率卻急劇下降，當(dāng)溫度為90℃，螯合率達(dá)到最高。分析原因可能是鰲合過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的反應(yīng)，當(dāng)溫度上升，加速了反應(yīng)離子的運(yùn)動(dòng)，加大了螯合反應(yīng)，鰲合反應(yīng)大于解離反應(yīng)，所以隨著溫度的上升螯合率增加，當(dāng)溫度大于90℃時(shí)，解離反應(yīng)大于螯合反應(yīng)，螯合率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。故溫度選擇90℃為適宜。

2.3.3 螯合時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)的影響 在溫度為60℃，氨基酸多肽∶離子鈣的質(zhì)量比為2∶1，pH值4，乙醇體積比 7∶1， 選取螯合時(shí)間，30、60、90、120、150 min做梯度試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，螯合率不斷升高，但是當(dāng)時(shí)間超過(guò)60 min后，螯合率曲線(xiàn)變化平緩。分析原因可能是離子和供電子基團(tuán)是不停的運(yùn)動(dòng)的，并不停的反應(yīng)，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，Ca+或者供電子基團(tuán)達(dá)到飽和，螯合率就不再增加。故時(shí)間選擇在60 min為適宜。

圖5 螯合時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.5 Influence of Time on Chelate Ratio

2.3.4 質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)的影響 在溫度為60℃，螯合時(shí)間為 60 min，pH值4，乙醇體積比7∶1選取氨基酸多肽∶離子鈣的質(zhì)量比為 1∶1、2∶1、4∶1、6∶1做梯度試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.6 Influence of mass ratio on chelate ratio

由圖6可以看出，隨著氨基酸多肽與鈣質(zhì)量比值升高，螯合率明顯增加，當(dāng)比值為4∶1時(shí)，螯合率最大，但比值從2∶1往后，螯合率變化很小，比值過(guò)大就造成了浪費(fèi)。當(dāng)氨基酸多肽與鈣質(zhì)量比值為2∶1為適宜。

2.4 螯合反應(yīng)的正交實(shí)驗(yàn)分析

為了進(jìn)一步優(yōu)化螯合工藝，選擇時(shí)間、溫度、鈣離子/氨基酸多肽質(zhì)量之比、pH 4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)并方差分析，結(jié)果如表2。

根據(jù)表2，可以得出螯合工藝的最佳組合是A2B2C2D3，因素影響順序：A＞B＞D＞C。 用最佳組合A2B2C2D3再次試驗(yàn)，得到螯合率為90.83%。因此，螯合工藝最佳條件是：溫度80℃、時(shí)間60 min、多肽/鈣離子質(zhì)量比為 2.5∶1、pH 為 5。

表2 酸解魚(yú)骨正交試驗(yàn)Table 2 Chelate reaction results of orthogonal test

3 結(jié)語(yǔ)

探討了以羅非魚(yú)下腳料酶解液和骨粉鈣螯合，制備氨基酸多肽螯合鈣的最優(yōu)工藝條件，得出以下結(jié)論：

1）利用鹽酸酸解魚(yú)骨粉的最佳條件：溫度50℃、時(shí)間100 min、鹽酸濃度4 mol/L、鹽酸添加量12 mL/g（以骨粉計(jì)）。

2）螯合反應(yīng)的最佳條件：pH 5、時(shí)間60 min、多肽液與鈣離子質(zhì)量比2.5∶1、溫度80℃。

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[3]高明俠，秦衛(wèi)東，苗敬芝.復(fù)合L-氨基酸螯合鈣對(duì)大鼠骨密度增加的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，27（2）：44-46.GAO Mingxia，QIN Weidong，MIAO Jingzhi.Effects on the raising of bone density by calcium complex L-Amino acid chelate compound in weaning rats[J].Journal of Food Science and Biotech Nology，2008，27（2）：44-46.（in Chinese）

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