代 晶，石明芯，王佳慧

兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)是生物體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶，能夠通過S-腺苷-L-甲硫氨酸使藥物發(fā)生甲基化反應，對其藥代動力學和藥效學產(chǎn)生影響。除此以外，其活性高低還與帕金森、精神分裂癥、抑郁癥、乳腺癌、白癜風等疾病存在相關性［1-3］。因此，測定COMT活性對于研究藥物與COMT的關系，診斷和治療某些疾病具有重要意義。COMT在肝中活性最高，而肝微粒體中含有豐富的Ⅱ相代謝酶，為了測定肝微粒體中COMT的活性，本試驗建立了同時測定COMT的底物(原兒茶酸)和其代謝產(chǎn)物(香草酸)含量的HPLC法。該方法簡單、靈敏、準確，可為COMT相關研究提供有效的分析手段。

1 材料

1.1 試劑 綠原酸(批號CAA-111101)購自成都天源天然產(chǎn)物有限公司;原兒茶酸(批號 Y-031-132012)和香草酸(批號X-030-120316)購自成都瑞芬思生物科技有限公司;甲醇(Dikma公司，色譜純)，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 Ultimate3000型高效液相色譜儀(美國Dionex公司):包括 P680泵、ASI-100自動進樣器、UV1700型檢測器，TC100柱溫箱，Chromeleon工作站。

1.3 實驗動物 健康成年的SD大鼠8只，雌雄各半，體重250～300 g，購自四川大學華西實驗動物中心，合格證號SYXK(川)2008-113。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制 分別取原兒茶酸、香草酸對照品適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、0.75 mg/ml的貯備液。取上述貯備液適量，用甲醇稀釋成系列濃度的對照品溶液，其中原兒茶酸的質(zhì)量濃度分別為200、100、50、20、10、5 μg/ml，香草酸分別為 150、75、37.5、15、7.5、3.75 μg/ml。取綠原酸(內(nèi)標)對照品適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為200 μg/ml的溶液。上述溶液置4℃冰箱，備用。

2.2 肝微粒體的制備與測定 參考文獻［4］的方法制備大鼠肝微粒，并測定蛋白濃度。

2.3 色譜條件 色譜柱:Welchrom C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱 溫 30 ℃，流 速 1.0 ml/min;流動相為甲醇∶0.1%磷酸(25∶75);原兒茶酸和香草酸檢測波長為260 nm，內(nèi)標檢測波長為326 nm。

2.4 樣品前處理方法 取原兒茶酸、香草酸對照品溶液50 μl，揮干溶劑，加入肝微粒體和 0.1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)溶液，使終體積為 0.5 ml，蛋白的終濃度為0.5 mg/ml，制成離體肝微粒樣品溶液。

比較3種前處理方法。方法1:向樣品溶液中加入2.0 ml甲醇和50 μl內(nèi)標溶液，渦旋沉淀蛋白3 min。然后以12 000 r/min離心10 min，取出全部上清液，于50℃氮氣流下吹干溶劑，殘留物用100 μl流動相溶解，13 500 r/min離心10 min，取出上清液20 μl進樣分析，計算提取回收率。

方法2:向樣品溶液加入2.0 ml乙酸乙酯和10 μl內(nèi)標溶液，渦旋萃取 3 min，靜止 3 min，取出全部有機層，于50℃氮氣流下吹干溶劑，殘留物用100 μl流動相溶解，取出 20 μl進樣分析。

方法 3:向樣品溶液中依次加入 50 μl(或100 μl)鹽酸(1 mol/L)和 2.0 ml乙酸乙酯，其余操作參照“方法2”。

結(jié)果顯示，“方法3”中 HCl為50 μl時，原兒茶酸和香草酸的提取率最大(表1)，故本試驗選擇該方法作為樣品前處理方法。

表1 3種前處理方法提取回收率結(jié)果比較(%)

2.5 系統(tǒng)適用性試驗 分別取空白肝微粒體、空白肝微粒體加各對照品溶液，參照“2.3”和“2.4”項下方法處理和分析樣品。在此條件下，原兒茶酸、內(nèi)標和香草酸保留時間分別為 7.0、9.9 和 14.0 min，理論塔板數(shù)分別大于8100、7400和11 000。各成分達基線分離，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾(圖1)。

圖1 空白肝微粒體(A)和空白肝微粒體加對照品(B)的高效液相色譜1：原兒茶酸;2：綠原酸（內(nèi)標）;3：香草酸

2.6 線性關系試驗 分別取原兒茶酸和香草酸系列標準溶液各50 μl揮干溶劑后，加入肝微粒溶液，每個濃度樣品一式3份，參照“2.3”和“2.4”項下方法處理和分析樣品。以各底物峰面積與內(nèi)標峰面積之比作為縱坐標(Y)，以各底物濃度作為橫坐標(X)進行線性回歸。同時以信噪比≥10計算定量下限(LLOQ)，以信噪比≥3計算檢測限(LOD)。結(jié)果顯示，原兒茶酸和香草酸分別在 0.5 ～20 μg/ml和0.375 ～15 μg/ml范圍內(nèi)線性關系良好，回歸方程分別是 Y=0.1268X-0.0856 和 Y=0.0363X-0.0034;相關系數(shù)依次是 0.9995 和 0.9999;LLOQ分 別 為 0.05 μg/ml和 0.03 μg/ml;LOD 均 為0.01 μg/ml。

2.7 精密度和回收率試驗 制備高、中、低3個濃度的質(zhì)控樣品溶液，每一濃度平行制備5份，參照“2.3”和“2.4”項下方法處理和分析樣品。1 d內(nèi)進樣分析，計算日內(nèi)精密度，連續(xù)測定3 d，計算日間精密度。將測定的底物與內(nèi)標峰面積之比代入回歸方程，計算方法回收率。再取同等濃度的各底物和內(nèi)標對照品溶液，直接揮干溶劑，流動相溶解后進樣分析，將肝微粒體內(nèi)的底物的標峰面積與對照峰面積進行比較，計算提取回收率。結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收率試驗結(jié)果(n=5)

2.8 穩(wěn)定性試驗 分別將低、中、高3個濃度的質(zhì)控溶液置于室溫和-20℃冰箱中保存。置于室溫的樣品分別于24 h和48 h后進行測定，置于-20℃冰箱中的樣品分別于3 d和7 d后測定含量。結(jié)果顯示，置于室溫的原兒茶酸和香草酸含量的RSD＜2.4% 和 RSD ＜3.2%，置于冰箱的RSD＜9.7%和RSD% ＜10.8%。表明質(zhì)控樣品在室溫48 h內(nèi)穩(wěn)定，在-20℃冰箱7 d內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

關于COMT活性測定方法主要包括HPLC(UV［5］、ECD［6］、FD［7］法和 GC-MS 法［8］等。ECD 法靈敏度較高，但檢測器并不普及;FD法和GC-MS法需要對樣品進行柱前衍生化處理，操作較麻煩。有學者采用HPLC-UV法測定COMT活性，但其采用直接沉淀蛋白方法處理樣品，以外標法定量。而本試驗將樣品酸化提取后再濃縮，這種方法將樣品處理得較干凈，極大地減少了內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，避免了殘留蛋白對色譜柱的污染，而且提高了檢測靈敏度。同時，為了減小操作和儀器誤差給結(jié)果帶來的影響，本試驗以內(nèi)標法進行定量，試驗表明綠原酸與待測物提取率接近，色譜行為相似，適合于原兒茶酸和香草酸的測定?？傊?，本試驗建立的方法簡單、靈敏、準確，適合于大鼠肝微粒體中COMT活性測定及相關研究。

［1］金遠香，劉潔.COMT的遺傳藥理學研究進展［J］.中國藥理學通報，2013，29(8):1041-1044.

［2］楊文亮，柳曉泉.CYP1和COMT介導的雌二醇代謝與乳腺癌的關系及相關抗癌藥的研發(fā)思路［J］.藥學進展，2010，34(5):202-209.

［3］王丹妮，權(quán)晟，袁鋒，等.COMT基因遺傳多態(tài)性與漢族人白癜風易感性關聯(lián)分析［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2009，44(3):302-304.

［4］代晶，楊萬清，廖林川.氯胺酮多次給藥對大鼠肝微粒體內(nèi)細胞色素P450-2B酶的誘導作用［J］.成都醫(yī)學院學報，2012，79(3):383-385.

［5］楊麗娜，肖盛元，鄧玉林.RP-HPLC法測定鼠肝組織兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶活性的研究［J］.現(xiàn)代科學儀器，2009，1(1):59-61.

［6］Tuomainen P，Reenila I，Mfinnist PT.Validation of assay of catechol-O-methyltransferase activity in human erythrocytes［J］.J Pharm Biomed Anal，1996，14(5):515-523.

［7］Masuda M，Tsunoda M，Imai K.High-performance liquid chromatography-fluorescent assay of catechol-O-methyltransferase activity in rat brain［J］.Anal Bioanal Chem，2003，376(6):1069-1073.

［8］Maurer HH，Bickeboeller-Friedrich J，Kraemer T.Gas chromatographic-massspectrometric procedures fordetermination ofthe catechol-O-methyltransferase(COMT)activity and for detection of unstable catecholic metabolites in human and rat liver preparations after COMT catalyzed in statu nascendi derivatization using S-adenosylmethionine［J］.J Chromatogr B Biomed Sci Appl，2000，739(2):325-335.