孫曉華，賴克強(qiáng)，黃軼群，王 婧，*，吳 軼，肖竹青

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306;2.上海市食品研究所，上海200235)

晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的一類(lèi)復(fù)雜的化合物，主要由脂質(zhì)氧化途徑和還原糖(及其氧化產(chǎn)物)與蛋白質(zhì)的游離氨基通過(guò)非酶褐變途徑產(chǎn)生［1］。食品熱加工的過(guò)程中容易產(chǎn)生AGEs，有研究者發(fā)現(xiàn)，大約10%的食源性AGEs可以被吸收進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，并隨著年齡的增長(zhǎng)在體內(nèi)累積［2］。人體內(nèi)AGEs的積累與人類(lèi)許多疾病都有著密不可分的關(guān)系，包括糖尿病、腎病、阿茨海默爾病、衰老和動(dòng)脈粥樣硬化等［3－4］。因此，控制 AGEs含量高的食品的攝入對(duì)于人類(lèi)預(yù)防這類(lèi)疾病尤其重要。AGEs主要包括:羧甲基賴氨酸(CML)、羧乙基賴氨酸(CEL)、戊糖素(Pento－s)、吡咯啉(Pyr)等。其中，CML最先在食品中被檢出，在實(shí)驗(yàn)室研究中通常被作為食品中AGEs產(chǎn)生的標(biāo)志性物質(zhì)［5］。

大多數(shù)AGEs可以自發(fā)熒光，許良元等人［6］主要研究了利用熒光光譜技術(shù)檢測(cè)人體中的AGEs。但CML不能自發(fā)熒光，傳統(tǒng)的用于 CML檢測(cè)的方法——酶聯(lián)免疫法(ELISA)［7－8］、高效液相色譜熒光檢測(cè)法(HPLC－ FLD)［5，9］、氣相色譜－ 質(zhì)譜聯(lián)用法(GC－MS)［10］都存在不同程度的缺陷。由于食品體系比較復(fù)雜，ELISA法特異性抗體選擇比較困難，定量分析結(jié)果不可靠;HPLC－FLD和GC－MS法都需要將樣品衍生化，樣品處理復(fù)雜，衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定。而高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC－MS/MS)可以避免復(fù)雜的樣品衍生化處理，能夠進(jìn)行準(zhǔn)確定量。目前已經(jīng)報(bào)道的 HPLC－MS/MS檢測(cè) CML 的方法［11－14］存在很大缺陷和不足，多數(shù)使用C18色譜柱進(jìn)行分離，C18固相萃取小柱進(jìn)行凈化。而CML極性極強(qiáng)，如要達(dá)到在C18柱上保留必須使用離子對(duì)試劑。而離子對(duì)試劑會(huì)降低色譜柱壽命并污染質(zhì)譜的離子源。本方法首次研究用HILIC親水作用色譜柱進(jìn)行分離，MCX混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱對(duì)提取液萃取凈化，在CML的提取和檢測(cè)過(guò)程中都無(wú)需使用離子對(duì)試劑即可得到適當(dāng)保留，同時(shí)避免了HPLC－FLD和GC－MS法復(fù)雜的樣品衍生化處理過(guò)程，分析時(shí)間短，簡(jiǎn)便快速。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

37%鹽酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉、甲酸、乙酸銨、三氯甲烷、95%乙醇、硼酸、硼酸鈉、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸銅、硫酸鉀、氨水、濃硫酸 分析純，國(guó)藥集團(tuán);甲醇 HPLC級(jí)，美國(guó) Sigma公司;CML標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，CAS號(hào) 5746－04－3)、D4－CML 標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)加拿大TRC公司。實(shí)驗(yàn)室用水為Milli－Q超純水。CML和D4－CML標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解在80%甲醇水溶液中，配成100mg/L溶液，儲(chǔ)存在－20℃冰箱里備用，可保存6個(gè)月。

2695 Quattro Micro型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(配套MassLynxV 4.1型數(shù)據(jù)采集及處理軟件)、Atlantis HILIC親水作用色譜柱(150mm ×2.1mm，3μm)、SunFire C18液相色譜柱(150mm × 2.1mm，5μm)、OASIS MCX混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱(60mg/3mL)美國(guó)Waters公司;DZF－6050型真空干燥箱 上海精宏真空設(shè)備有限公司;TDL－5－A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;UDK159全自動(dòng)凱氏定氮儀 意大利VELP公司;Milli－Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司;Supelclean LC－18固相萃取小柱(500mg/3mL)、Supelclean Alumina A酸性氧化鋁小柱(100mg/3mL)美國(guó)Supelco公司;CNW SCX陽(yáng)離子交換固相萃取小柱(500mg/3mL)上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC條件 Atlantis HILIC親水作用色譜柱(150mm ×2.1mm，3μm);進(jìn)樣量 10μL;流動(dòng)相速率0.2mL/min;柱溫35℃;流動(dòng)相A為甲醇(含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸銨)，B為水(含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸銨)。進(jìn)行梯度洗脫，洗脫參數(shù)如表1所示。

表1 梯度洗脫參數(shù)Table 1 Parameters for procedure of gradient elution

1.2.2 MS/MS條件 電噴霧離子源(ESI);正離子掃描模式，駐留時(shí)間500ms;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM);離子源溫度120℃，脫溶劑溫度350℃;進(jìn)樣錐電壓20V，毛細(xì)管電壓3.00kV;脫溶劑氣和錐孔氣為氮?dú)猓撊軇饬魉?00L/h，錐孔氣流速50L/h，碰撞氣體為氬氣。

1.2.3 樣品處理 從上海市15個(gè)不同的油條加工點(diǎn)(包括市場(chǎng)上普通的早餐攤點(diǎn)A和四種品牌的連鎖餐飲店B、C、D、E各3個(gè)加工點(diǎn))采集油條樣品，樣品經(jīng)真空干燥后粉碎混勻。參考 Niquet－Léridon等［12］的研究進(jìn)行樣品前處理。稱(chēng)取0.5g粉末狀樣品，加入2mL硼酸鈉緩沖液(0.2mol/L，pH 9.2)和0.4mL硼氫化鈉溶液(2mol/L，含0.1mol/L氫氧化鈉)，混勻后在－4℃冰箱中放置8h進(jìn)行還原反應(yīng)。根據(jù) Folch 法［15］，加入4mL 三氯甲烷－甲醇(2∶1，v∶v)溶液除去油條樣品中的油脂，同時(shí)使蛋白質(zhì)沉淀。5000r/min離心10min后，在沉淀物中加入4mL鹽酸溶液(6mol/L)，在110℃條件下酸解24h。酸解液經(jīng)真空干燥，用4mL超純水再溶解后，取1mL再溶解溶液用水定容至50mL(添加內(nèi)標(biāo)物D4－CML，使其在最終樣品溶液中濃度為100μg/L)。用3mL甲醇和3mL水分別洗凈和活化MCX小柱，取2mL上述添加D4－CML的樣品溶液過(guò)柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗凈雜質(zhì)后，用5mL含5%氨水的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液經(jīng)氮吹濃縮后，重新溶解在2mL甲醇－水(80∶20，v∶v)溶液中，得到最終樣品溶液，取適量此溶液過(guò)0.22μm有機(jī)相濾膜后，用于HPLC－MS/MS分析。

根據(jù) GB 5009.5－2010 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定［16］，采用凱氏定氮法對(duì)油條中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取凈化小柱的選擇

比較了C18SPE小柱、酸性氧化鋁小柱、SCX和MCX陽(yáng)離子交換柱四種固相萃取小柱對(duì)加標(biāo)提取液的保留和凈化效果。C18小柱不能將CML完全保留住，在上樣流出液(應(yīng)棄去部分)中檢測(cè)出CML和D4－CML;酸性氧化鋁小柱凈化后，CML被保留在小柱內(nèi)不能流出;而經(jīng)SCX和MCX陽(yáng)離子交換柱凈化后，兩者的回收率都接近100%，但MCX陽(yáng)離子交換小柱對(duì)提取液的凈化效果較SCX陽(yáng)離子交換小柱好。因此，本方法采用MCX陽(yáng)離子交換柱凈化。

2.2 液相色譜柱的選擇

比較了C18色譜柱和HILIC色譜柱對(duì)CML的保留效果。在不使用離子對(duì)試劑的前提條件下，用5%甲醇(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)－95%水(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)作為流動(dòng)相，使用C18色譜柱進(jìn)樣(100μg/L CML標(biāo)準(zhǔn)溶液)分析;用80%甲醇(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)－20%水(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)作為流動(dòng)相，使用HILIC色譜柱進(jìn)樣(100μg/L CML標(biāo)準(zhǔn)溶液)分析;結(jié)果如圖2、3所示，在C18柱中，CML的保留時(shí)間僅為1.21min，而在HILIC柱中的保留時(shí)間為3.47min。因此選用HILIC色譜柱可以不使用離子對(duì)試劑，能達(dá)到有效的保留CML，使其與雜質(zhì)完全分離。

圖1 使用C18色譜柱時(shí)CML(100μg/L)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion spectrum of CML using C18column

圖2 使用HILIC柱時(shí)CML(100μg/L)的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion spectrum of CML using HILIC column

2.3 流動(dòng)相的選擇

選擇CML標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/L)進(jìn)樣，通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較了流動(dòng)相甲醇－水和流動(dòng)相乙腈－水對(duì)CML的洗脫效果，結(jié)果表明甲醇作為有機(jī)相時(shí)，CML的峰形更尖銳，因此流動(dòng)相選擇了甲醇和水。沒(méi)有添加乙酸銨和甲酸時(shí)，CML不出峰或者色譜峰拖尾嚴(yán)重，可能是由于標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液pH的差異較大所致。在甲醇和水相中分別添加了2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸，提高了離子化效率，改善了峰形，提高了靈敏度，從而降低了檢測(cè)限。實(shí)驗(yàn)還討論了不同的流動(dòng)相比例對(duì)CML保留時(shí)間和峰形的影響，分別選取了90%、80%、50%三個(gè)甲醇濃度作為流動(dòng)相。結(jié)果在確保色譜柱對(duì)CML的保留效果的同時(shí)，80%甲醇濃度得到的CML峰形最優(yōu)，響應(yīng)最強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上，為了增強(qiáng)CML與雜質(zhì)的分離效果，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化采取了梯度洗脫程序(見(jiàn)表1)。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對(duì)CML進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，CML母離子m/z 205.4主要被打碎成m/z 130.2，m/z 83.8兩類(lèi)離子碎片，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11－14］。本方法采用 m/z 130.2為定量離子，CML的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 CML的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS fragments of CML

對(duì)錐孔電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，CML和D4－CML優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 MRM模式下CML和D4－CML的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass parameters in multiple reaction monitoring(MRM)mode for CML and D4－CML

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 儀器檢出限 配制成CML濃度分別為0、1、10、50、100μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液(其中內(nèi)標(biāo) D4－CML 濃度均為10μg/L)。經(jīng)HPLC－MS/MS檢測(cè)，得到CML和D4－CML混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖(圖4)，D4－CML和CML的保留時(shí)間均為3.47min。分別以S/N=3和S/N=10的計(jì)算方法得出儀器檢出限(LOD)為1μg/L，定量限(LOQ)為 3μg/L，表明本方法具有較高的靈敏度。

2.5.2 添加回收率和精密度 向油條酸解液中添加CML和D4－CML標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)量分別為10、20、100μg/kg。每個(gè)添加濃度平行測(cè)定6次(n=6)。見(jiàn)表3，添加回收率為89.5%～99.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～2.6%，回收率和精密度較高。由于油條中CML含量較高，將樣品稀釋了200倍后(與添加CML濃度相當(dāng))進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，樣品基質(zhì)也得到了稀釋?zhuān)蚨|(zhì)效應(yīng)小，定量準(zhǔn)確度高。

2.6 油條中CML含量的測(cè)定

采集市場(chǎng)上15個(gè)不同加工點(diǎn)(包括市場(chǎng)上普通的早餐攤點(diǎn)A和四種品牌的連鎖餐飲店B、C、D、E)的油條經(jīng)樣品處理后，用已建立的HPLC－MS/MS法進(jìn)行CML含量測(cè)定。每個(gè)樣品平行測(cè)定三次(n=3)，測(cè)得15種不同油條樣品中的蛋白質(zhì)和CML含量見(jiàn)表4。油條中CML含量范圍為5.3±0.5～15.4±0.3mg/(kg樣品)，也可以用油條中蛋白質(zhì)含量來(lái)表示為69.3±8.2～182.2±3.1mg/(kg蛋白質(zhì))。

圖4 CML和D4－CML混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of CML and D4－CML mixed standard solution

由表中數(shù)據(jù)可以看出，不同來(lái)源的油條樣品中CML含量有所差異;市場(chǎng)上普通早餐攤點(diǎn)的油條中CML含量稍高于四個(gè)不同品牌連鎖店的油條;四個(gè)不同品牌連鎖店之間的油條中CML含量有較大差異。蛋白質(zhì)含量高的樣品中CML含量相對(duì)較高，不同的油條加工點(diǎn)對(duì)油炸溫度和油炸時(shí)間的控制上的差異也會(huì)導(dǎo)致美拉德反應(yīng)程度的不同，因而使晚期糖基化終末產(chǎn)物中CML的產(chǎn)生量有所不同。

表3 油條中CML的添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 3 Recovery rate of CML in fried bread sticks(n=6)

3 結(jié)論

本研究對(duì)食品中CML的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，樣品處理無(wú)需衍生化;利用MCX固相萃取小柱凈化和HILIC色譜柱對(duì)強(qiáng)極性的CML進(jìn)行分離，無(wú)需使用離子對(duì)試劑即可得到有效保留;建立的HPLCMS/MS CML檢測(cè)法成功地應(yīng)用于具有中國(guó)特色的油炸食品(油條)的檢測(cè)中。本方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高、靈敏度好，為進(jìn)一步研究不同種類(lèi)食品中CML含量的檢測(cè)、研究食品加工過(guò)程中影響CML的產(chǎn)生因素以及研究CML與人類(lèi)疾病(糖尿病、尿毒癥、動(dòng)脈粥樣硬化等)的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為指導(dǎo)人們改進(jìn)食品加工工藝提供依據(jù)。

表4 15種不同來(lái)源油條樣品中CML含量和蛋白質(zhì)含量(n=3)Table 4 CML content and protein content in 15 different source fried bread sticks(n=3)

［1］Bengmark，S.Advanced glycation and lipoxidation end products－amplifiers of inflammation:The role of food［J］.Journal of Parenteral and Enteral Nutrition，2007，31(5):430－440.

［2］Somoza V，Wenzel E，Weiss C，et al.Dose－ Dependent utilisation ofcasein－linked lysinoalanine，N(epsilon)－fructoselysine and Nε－ carboxymethyllysine in rats［J］.Molecular Nutrition ＆ Food Research，2006，50:833－841.

［3］Wang Z Q，Jiang Y C，Liu N F，et al.Advanced glycation end－product Nε－carboxymethyl－Lysine accelerates progression of atherosclerotic calcification in diabetes［J］.Atherosclerosis，2012，221:387－396.

［4］馮建勛，李紅艷，田建偉.飲食中晚期糖基化終產(chǎn)物對(duì)健康SD大鼠腎臟的影響［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10(36):116－119.

［5］Hartkopf J，Pahlke C，Liidemann G，et al.Determination of Nε－carboxy－methyllysine by a reversed－phase high－performance liquid chromatography method［J］.Journal of Chromatography A，1994，672:242－246.

［6］許良元，朱靈，張龍，等.晚期糖基化終末產(chǎn)物熒光光譜測(cè)量系統(tǒng)的設(shè)計(jì)［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(8):2298－2301.

［7］Goldberg T，Cai W，Peppa M，et al.Advanced glycoxidation end products in commonly consumed foods［J］.Journal of the American Dietetic Association，2004，104(8):1287－1290.

［8］Uribarri J，Woodruff S，Goodman S，et al.Advanced Glycation End Products in Foods and a Practical Guide to Their Reduction in the Diet［J］.Journal of the American Dietetic Association，2010，110:911－916.

［9］Drusch S，F(xiàn)aist V，Erbersdobler H F.Determination of Nεcarboxymethyllysine in milk products by amodified reversedphase HPLC method［J］.Food Chemistry，1999，65:547－553.

［10］Charissou A，Ait－Ameur L，Birlouez－Aragon I.Evaluation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the quantification of carboxymethyllysine in food samples［J］.Journal of Chromatography A，2007，1140:189－194.

［11］Assar S H，Moloney C，Lima M，et al.Determination of Nε－(carboxymethyl)lysine in food systems by ultra performance liquid chromatography － mass spectrometry［J］.Amino Acids，2009，36(2):317－326.

［12］Niquet － Léridon C，Tessier F J.Quantification of Nε－carboxymethyl(lysine)in selected chocolate－flavoured drink mixes using high－performance liquid chromatography－linear ion trap tandem mass spectrometry［J］.Food Chemistry，2011，126:655－663.

［13］Hull G L J，Woodside J V，Ames J M，et al.Nε－(carboxymethyl)lysine content of foods commonly consumed in a Western style diet［J］.Food Chemistry，2012，131:170－174.

［14］Zhang G，Huang G W，Lu X，et al.Determination of Advanced Glycation Endproducts by LC－MS/MS in Raw and Roasted Almonds(Prunus dulcis)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59:12037－12046.

［15］Folch J，Less M，Stanley G H S.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues［J］.Journal of Biological Chemistry，1957，226:497－509.

［16］食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).GB 5009.5－2010.