汪振炯，王仁雷，吳雨龍，周 峰，華 春，* ，顧忠美，曹志敏，何 盟，陳曉鵬，3

(1.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇南京211171;2.江蘇第二師范學(xué)院，江蘇南京210013;3.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210046)

蛹蟲草(Cordyceps militaris)，又名北冬蟲夏草，與著名的中藥材冬蟲夏草(Chinese Caterpillar Fungus)歸為同一個(gè)屬。蛹蟲草是蟲菌結(jié)合的中藥材，其菌體內(nèi)含有多種生物活性成分，可與冬蟲夏草相媲美［1］。蛹蟲草可以人工栽培，目前從大米、高粱米、小米、玉米渣等多種基質(zhì)上均可培養(yǎng)出蛹蟲草子實(shí)體［2－3］。但是，在蛹蟲草的規(guī)模化栽培中發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草的人工栽培需要消耗大量的人力物力，產(chǎn)量不高，并且在其栽培后會(huì)有大量的廢基質(zhì)產(chǎn)生，通常被當(dāng)作廢物扔掉。而這些廢基質(zhì)中含有大量蛹蟲草菌絲體，造成寶貴資源浪費(fèi)。

蟲草多糖是蛹蟲草菌絲體中含量最多的藥理活性物質(zhì)，大量研究表明，蟲草多糖有著多種生物活性功能，如具有抗腫瘤、降血糖、抗肝纖維化，抗氧化活性，抗菌活性等作用，并可增強(qiáng)單核巨嗜細(xì)胞系統(tǒng)的功能，提高免疫力，治療肝病毒性感染等［4－5］，具有廣闊的開發(fā)前景。因此，從蟲草的廢棄培養(yǎng)基中提取蛹蟲草多糖，對(duì)提高蛹蟲草人工栽培的附加值和生產(chǎn)保健食品和藥品等具有重要意義。

隨著現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展，超聲、微波和生物酶技術(shù)在多糖等生物活性物質(zhì)提取工藝中的應(yīng)用得到廣泛的關(guān)注，且有不少報(bào)道［6－8］。目前，國內(nèi)外有關(guān)蛹蟲草培養(yǎng)基中蟲草基質(zhì)多糖的提取報(bào)道，多集中于傳統(tǒng)的水浴提取法，亦有微波和超聲波助提等［9－12］。本文采用微波協(xié)同酶法提取基質(zhì)多糖，利用酶降解、破壞菌絲體細(xì)胞壁，并采用微波促使多糖成分溶出，提高多糖的得率，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期提高基質(zhì)多糖得率，為蛹蟲草基質(zhì)多糖的進(jìn)一步純化和活性研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為蛹蟲草保健食品的開發(fā)提供一條新的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂蛹蟲草培養(yǎng)基基質(zhì)，過60目篩 海安泓壽生物技術(shù)有限公司;纖維素酶(酶比活力50000U/g)江蘇銳陽生物科技有限公司;硫酸(CP)無錫市晶科化工有限公司;無水乙醇(AR)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;苯酚(AR)汕頭市西隴化工廠有限公司。

紫外－可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;PHS－3C型pΗ計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;格蘭仕微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器有限公司;Centrifuge 5810R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司，上海安亭科學(xué)儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE－3000 上海亞榮生化儀器廠;SHZ－111型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝 準(zhǔn)確稱取脫脂蟲草基質(zhì)粉末1g→緩沖液調(diào)pH→纖維素酶酶解→滅酶冷卻→微波提取→冷卻→過濾后得上清液→濃縮→加4倍體積90%乙醇于4℃冰箱靜置12h→離心(4600r/min，10min)→收集沉淀→真空干燥得蛹蟲草粗多糖。

1.2.2 多糖含量測(cè)定及得率計(jì)算 采用苯酚－硫酸法測(cè)定蛹蟲草多糖含量［13］。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精確稱取105℃干燥恒重的葡萄糖100mg，置100mL容量瓶中定容。準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)溶液 20、40、60、80、100、120、140μL，分置于比色管中，各補(bǔ)加蒸餾水至體積為2.0mL，再分別加入5%的苯酚1.0mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0mL，充分搖勻后靜置30min，補(bǔ)充濃硫酸至刻度，以蒸餾水為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:y=6.0845x+0.0121，R2=0.9939。

多糖得率的計(jì)算:粗多糖得率以1g干品中提取出來的粗多糖總量的百分含量表示，計(jì)算公式如下:

蟲草多糖得率(%)=多糖的質(zhì)量/培養(yǎng)基基質(zhì)樣品干物質(zhì)的質(zhì)量×100

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 料液比對(duì)多糖提取的影響 以蒸餾水為提取液，在纖維素酶用量1500U/g、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間40min、酶解體系pH5.5、微波功率480W、微波時(shí)間 3min 的條件下，料液比依次為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 下提取，測(cè)定其在 490nm 下的吸光度，并計(jì)算得率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.2 酶添加量對(duì)多糖提取的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間40min、酶解體系 pH5.5、微波功率480W、微波時(shí)間3min的條件下，纖維素酶用量依次為 500、1000、1500、2000、2500、3000U/g 下提取，測(cè)定其在 490nm下的吸光度，并計(jì)算得率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.3 酶解pH對(duì)多糖提取的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、纖維素酶用量1500U/g、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間40min、微波功率480W、微波時(shí)間3min的條件下，酶解體系 pH 分別為3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5下提取，測(cè)定其在490nm下的吸光度，并計(jì)算得率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.4 酶解溫度對(duì)多糖提取的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、纖維素酶用量1500U/g、酶解體系pH5.5、酶解時(shí)間40min、微波功率480W、微波時(shí)間3min的條件下，酶解溫度依次為35、40、45、50、55、60、65℃下提取，測(cè)定其在490nm下的吸光度并計(jì)算得率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.5 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、纖維素酶用量1500U/g、酶解溫度50℃、酶解體系pH5.5、微波功率480W、微波時(shí)間3min的條件下，酶解時(shí)間依次為10、20、30、40、50、60min下提取，測(cè)定其在490nm下的吸光度并計(jì)算得率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.6 微波功率對(duì)多糖得率的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、纖維素酶用量1500U/g、酶解溫度50℃、酶解體系pH5.5、酶解時(shí)間40min，微波時(shí)間3min的條件下，微波功率依次為320、400、480、560、640、720、800W 下提取，測(cè)定其在 490nm 下的吸光度并計(jì)算得率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.7 微波處理時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、纖維素酶用量1500U/g、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間40min、酶解體系pH5.5、微波功率480W的條件下，微波時(shí)間依次為1、2、3、4、5、6min下提取，測(cè)定其在490nm下的吸光度并計(jì)算得率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取纖維素酶用量、酶解時(shí)間、微波功率、微波處理時(shí)間4個(gè)因素作為自變量，并分別以多糖得率作為響應(yīng)值，采用Box－Behnken法設(shè)計(jì)四因素三水平的二次回歸方程擬合因素和指標(biāo)(響應(yīng)值)之間的函數(shù)關(guān)系，并采用響應(yīng)面分析法分析各因素之間的交互作用，確定最佳的工藝參數(shù)，因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面模型的因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels for response surface design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素條件對(duì)蛹蟲草基質(zhì)多糖得率的影響

2.1.1 料液比的確定 不同料液比對(duì)多糖得率的影響結(jié)果見圖1。料液比小于1∶30時(shí)，多糖得率隨液料比的增大而增加，當(dāng)料液比大于1∶30后，多糖的提取曲線趨于平緩，甚至略有下降。水量增加利于水溶性的蟲草基質(zhì)多糖溶出，但加水量過大之后，會(huì)增加濃縮過程中工作量和能耗負(fù)擔(dān)，同時(shí)增大了濃縮過程中多糖損耗，從而影響多糖得率，不利于實(shí)際操作和生產(chǎn)。

圖1 料液比對(duì)蟲草基質(zhì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid－liquid ratio on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.2 酶添加量對(duì)多糖提取的影響 不同纖維素酶用量對(duì)蛹蟲草基質(zhì)多糖提取的影響如圖2所示。隨著纖維素酶添加量的增加，多糖的提取量不斷增加;當(dāng)酶添加量至1500U/g，多糖得率的增加呈現(xiàn)出相對(duì)平緩的趨勢(shì)。經(jīng)纖維素酶處理后，多糖的提取量顯著提高。這是因?yàn)榫z體的主要成分是纖維素，纖維素被酶解后，加快了蟲草多糖的溶出，從而提高了多糖提取量［10］。

圖2 纖維素酶添加量對(duì)蟲草多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzyme contents on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.3 酶解pH對(duì)多糖提取的影響 pH是影響酶活的主要因素。由不同酶解pH下蛹蟲草基質(zhì)多糖的得率(圖3)可知，當(dāng)pH為5.5時(shí)，多糖的得率最高。pH增大或減小，得率均開始下降。說明在pH5.5時(shí)的纖維素酶活較強(qiáng)，pH過高或過低均會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致得率下降。選取酶解pH在5～6之間比較合適。

圖3 pH對(duì)蟲草基質(zhì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.4 酶解溫度對(duì)多糖提取的影響 酶解溫度對(duì)蛹蟲草基質(zhì)多糖提取的影響如圖4所示。溫度會(huì)影響纖維素酶的活性，由圖4可知，酶解溫度在35～50℃時(shí)，隨著溫度升高，多糖的得率不斷增大，在50℃達(dá)到最大值。當(dāng)酶解溫度大于50℃時(shí)，纖維素酶活性受到抑制，多糖得率隨溫度升高反而逐漸下降。因此酶解溫度在50℃為宜。

圖4 酶解溫度對(duì)蟲草基質(zhì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取的影響 由圖5可知，酶解時(shí)間低于30min時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加多糖的得率不斷增加，多糖得率提高比較顯著，30～40min之間得率的增加不明顯，40min之后得率有略微下降趨勢(shì)。故酶解時(shí)間以30～50min為宜。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)蟲草基質(zhì)多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.6 微波功率對(duì)多糖得率的影響 由圖6可知，多糖得率隨著微波功率的增大先增加后減小。當(dāng)微波輻射時(shí)間一定時(shí)，微波功率越高，物系吸收微波能越多，菌絲體細(xì)胞內(nèi)部溫度上升越快，對(duì)基質(zhì)中的細(xì)胞壁的破壞作用就越大，有利于物料有效成分浸出，從而增加多糖的得率。但如果功率過高，得率會(huì)有所下降，因瞬間加熱作用會(huì)使被處理成分發(fā)生變性，對(duì)提取介質(zhì)的滲入造成較大的阻礙，同時(shí)，局部溫度過高，可能會(huì)導(dǎo)致多糖類化合物的分解，從而導(dǎo)致有效成分得率下降，因此適宜的微波功率應(yīng)該在400～600W之間。

圖6 微波功率對(duì)蟲草基質(zhì)多糖得率的影響Fig.6 Effect of microwave power on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.7 微波處理時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 不同微波處理時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響結(jié)果見圖7。隨時(shí)間增加多糖得率快速升高，微波處理4min時(shí)達(dá)到最高值，其原因在于微波短時(shí)間內(nèi)即對(duì)菌絲體細(xì)胞產(chǎn)生很大破壞作用，提高溶出物的量，從而提高多糖得率。之后隨時(shí)間增加，多糖得率有下降趨勢(shì)，因?yàn)槲⒉ㄌ幚頃r(shí)間過長(zhǎng)，不但會(huì)由于微波能的過剩，造成物料的焦糊和變性，影響提取的正常進(jìn)行［14］，而且會(huì)促進(jìn)非多糖類物質(zhì)的溶出，使產(chǎn)品的純度降低，表現(xiàn)為產(chǎn)品得率下降。故選取3～5min作為微波提取時(shí)間考查范圍。

圖7 微波提取時(shí)間對(duì)蟲草基質(zhì)多糖得率的影響Fig.7 Effect of microwave extract time on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)模型的建立 響應(yīng)面分析結(jié)果見表2，運(yùn)用design expert 8.06程序?qū)?9個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值Y分別進(jìn)行回歸分析，并建立相應(yīng)的響應(yīng)面回歸模型，得到回歸方程如下:

2.2.2 方差分析 對(duì)表2進(jìn)行方差分析，其結(jié)果分別見表3。一般情況下，決定系數(shù)(R2)反映方程對(duì)數(shù)據(jù)的擬合程度，在0～1之間取值，Joglekar等指出R2大于0.80表明方程的擬合情況較好［15］?；貧w方程的R2為0.9640，該模型可以解釋96.4%的響應(yīng)值變化，表明各因子與多糖提取得率之間的線性關(guān)系很好;因此方程具有良好的擬合程度，可以對(duì)酶－微波法提取蛹蟲草培養(yǎng)基基質(zhì)多糖進(jìn)行得率的分析和預(yù)測(cè)。此外，從表3的方差分析結(jié)果可得，所得的蛹蟲草多糖提取得率的回歸方程極顯著(p＜0.0001)，且失擬檢驗(yàn)不顯著，說明該回歸模型比較理想。從4個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響來看，回歸方程一次項(xiàng)中，X2－酶解時(shí)間、X3－微波功率、X4－微波時(shí)間均對(duì)多糖得率有極顯著的影響，且影響順序?yàn)閄3＞X2＞X4。二次項(xiàng)中影響顯著;交互項(xiàng)中，X1X2、X1X4、X2X3、X3X4對(duì)多糖提取得率的影響顯著，X1X3、X2X4不顯著。

表2 Box－Benhnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Box－Banhken experiment

2.2.3 模型的驗(yàn)證 為了解回歸模型的預(yù)測(cè)能力，對(duì)其進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，可以得到蛹蟲草基質(zhì)多糖得率的最佳平衡響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的因素條件為加酶量1630U/g、酶解時(shí)間 43.82min、微波功率 480.82W，微波時(shí)間3.34min，在此條件下得出的多糖得率預(yù)測(cè)值為18.17%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將參數(shù)修正為加酶量1650U/g、酶解時(shí)間44min、微波功率480W、微波時(shí)間3.5min。按照上述修正的優(yōu)化提取條件進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到實(shí)際測(cè)得的平均得率為18.45%。與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差在0.5%以內(nèi)，表明該模型具有很好的有效性，可以用來預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具有一定的參考價(jià)值。

表3 蛹蟲草多糖得率回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis for regression equation of the extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

3 結(jié)論

通過單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)研究，獲得了微波酶解協(xié)同法提取蛹蟲草多糖的最佳提取工藝，即料液比為1∶30，纖維素酶用量 1650U/g，在 55℃、pH5.5 條件下，酶解處理44min后進(jìn)行微波提取，微波功率為微波功率480W、提取時(shí)間3.5min，最終多糖得率為18.45%，微波協(xié)同纖維素酶法從蛹蟲草培養(yǎng)基質(zhì)中提取蟲草多糖可以提高效率，節(jié)約成本，提高多糖得率。

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