金 鑫，張彥芬，秘 堯，何其龍，周升山，張會欣，，崔雯雯

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.河北以嶺醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局重點研究室，河北 石家莊 050035；3.河北省絡病重點實驗室，河北石家莊 050035）

近幾十年來，由于人類久坐不動的生活方式和高卡路里的飲食，糖尿病等代謝性疾病已成為繼惡性腫瘤、心血管疾病后危害人類生命健康安全的第三大非傳染性疾病，成為了大多數(shù)國家的公共衛(wèi)生問題［1］。近年來，一些中成藥的降糖效果得到認可，在糖尿病治療方面取得了可喜成果。降糖中成藥津力達（Jinlida，JLD）能夠降低糖尿病患者的膽固醇、甘油三酯等水平，但其具體的作用機制還不明確。高脂誘導具有脂代謝紊亂遺傳背景的ApoE－／－小鼠，使其成為具有胰島素抵抗（IR）表現(xiàn)特征的模型，更貼近人類發(fā)病方式。IR是引起糖尿病等代謝性疾病的一個重要特征，而骨骼肌又是IR發(fā)生的重要部位［2－3］。我們觀察高脂誘導的 IR狀態(tài)下的ApoE－／－小鼠的骨骼肌膽固醇相關基因的變化，來探討津力達改善IR的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 津力達顆粒由人參、黃精、蒼術（炒）、苦參、麥冬等17味中藥組成，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，批號：120429；鹽酸羅格列酮片由貴州圣濟堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號20120202；油紅O染色試劑盒購自南京建成科技有限公司；胰島素受體（INSR）、胰島素受體底物（IRS-1）、低密度脂蛋白受體（LDLR）抗體均購于Abcam公司；固醇調節(jié)元件結合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）抗體購于 Santa Cruz公司；INSR、IRS-1、LDLR、SCAP引物均購自上海生工生物公司。

1.2 實驗動物 ApoE－／－小鼠、C57BL／6J小鼠，♂，18～20g，SPF級，均購自北京大學醫(yī)學部，許可證號：SCXK（京）2011－0012，動物合格證號：C57BL／6J小鼠（0302333），ApoE－／－小鼠（0302331）。

1.3 實驗飼料 實驗基礎飼料購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，配方：熱量組成：碳水化合物65.5%，脂肪 10.3%，蛋白質 24.2%，總熱量為348kcal／100 g；自制高脂飼料熱量組成：碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白質占20.1%，總熱量為501kcal／100 g。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 10只♂ C57BL／6J小鼠設為正常對照組（NF），給予正常飼料；50只♂ ApoE－／－小鼠，給予高脂飼料，喂養(yǎng)16周后，分為5組：模型組（HF）、羅格列酮組 （LGLT）、津力達高劑量組（JLDH）、津力達中劑量組（JLDM）。津力達低劑量組（JLDD），津力達用純水配制，按照小鼠體重高劑量 3.8 g·kg－1·d－1、中劑量 1.9 g·kg－1·d－1、低劑量0.95 g·kg－1·d－1灌胃給藥，鹽酸羅格列酮片按1.33 mg·kg－1·d－1灌胃給藥。正常對照組、模型組給予純水，連續(xù)8周，處死小鼠后，留取血清；骨骼肌股四頭肌標本，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 血清生化指標檢測 空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）均在全自動生化分析儀上檢測。

1.4.3 胰島素敏感性評價 空腹血清胰島素（FINS）水平測定采用放射免疫分析法檢測，計算胰島素敏感指數(shù)（ISI）評價其胰島素抵抗程度，ISI＝1／（FBG×FINS）。

1.4.4 形態(tài)學檢測 少量新鮮骨骼肌組織進行冰凍切片，切片采用油紅O染色方法光鏡下觀察小鼠骨骼肌脂肪蓄積程度。

1.4.5 骨骼肌TC代謝相關代謝基因mRNA表達水平的檢測 取小鼠骨骼肌組織勻漿，并用Trizol法提取總RNA后，反轉錄反應。采用實時熒光定量反轉錄PCR（RT-PCR）方法檢測小鼠骨骼肌INSR、IRS-1、LDLR、SCAP mRNA的表達。內參 β-actin及各目的基因引物序列如下：INSR上游引物：5′-TTTGCCCAACCATCTGTAAG-3′，下 游 引 物：5′-GACCATCCAGGTAGAAGTTTCG-3′；IRS-1上游引物：5′-AAGGAGGTCTGGCAGGTTATC-3′，下游引物：5′-ATGGTCTTGCTGGTCAGGC-3′；LDLR 上 游 引 物：5′-TGAAGAATGTGGTGGCTCTC-3′，下游引物：5′-ACTGATGATGGTGTCGTAGGA-3′；SCAP上游引物：5′-CAAAGAGGAGATTGGCATTG-3′，下 游 引 物：5′-TGCGTGTGGAGAAGTAGATGT-3′；β-actin上 游 引物：5′-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3′，下游引物：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。反 應 結束 后，按照各反應孔Ct值，以β-actin基因為內參，根據(jù)公式2－△Ct計算各樣品目的基因相對表達量。

1.4.6 骨骼肌組織膽固醇代謝相關蛋白表達水平測定 采用Western blot法測定小鼠骨骼肌INSR、IRS-1、LDLR、SCAP蛋白表達水平。取骨骼肌組織100 mg，加入1 ml細胞裂解液，充分裂解并定量。取30μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，完畢后，對凝膠進行半干轉膜，轉膜完畢取出，聚偏氟乙烯膜室溫封閉2 h，將封閉后的聚偏氟乙烯膜置入稀釋的一抗溶液中，4℃緩慢搖動過夜。洗膜后，將聚偏氟乙烯膜置入適量稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中，于室溫反應2 h?？贵w結合區(qū)帶用化學發(fā)光法檢測。以目的蛋白的IOD與β-actin的IOD比值表示該樣品的目的蛋白相對含量。

1.4.7 統(tǒng)計學處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，各項數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 血清生化指標比較 與NF組相比，HF組小鼠FBG、TC、TG、LDL-C均明顯升高，HDL-C明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與HF組相比，LGLT、JLDH組小鼠 FBG明顯降低（P＜0.05）；LGLT、JLDL、JLDM、JLDH組小鼠 TC明顯降低（P＜0.05）；LGLT、JLDM、JLDH組小鼠 TG含量降低（P＜0.05）；JLDM、JLDH組小鼠HDL-C明顯升高（P＜0.05）；JLDH組小鼠 LDL-C明顯降低（P＜0.05）。見Tab 1。

2.2 胰島素敏感性評價 與NF組相比，HF組FINS水平升高，ISI降低（P＜0.05）；與HF組比較，LGLT組、JLDG組、JLDM組、JLDL組FINS水平明顯下降，ISI均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見 Tab 2。

Tab 1 Effects of JLD on biochemical parameters in blood（±s）

Tab 1 Effects of JLD on biochemical parameters in blood（±s）

＃P＜0.05 vs NF group；*P＜0.05 vs HF group

?

Tab 2 Effects of JLD on FINS and ISI±s）

Tab 2 Effects of JLD on FINS and ISI±s）

＃P＜0.05 vs NF group；*P＜0.05 vs HF group

Group FINS／mU·L－1ISI NF 27.72±7.88 －5.05±0.39 HF 143.15±8.54＃ －7.03±0.13＃LGLT 56.85±11.08* －5.88±0.28*JLDL 119.82±4.89* －6.80±0.11*JLDM 92.13±9.78* －6.51±0.16*JLDH 60.09±12.05* －5.97±0.27*

2.3 骨骼肌油紅O染色 NF組小鼠的骨骼肌基本沒有脂肪蓄積，而HF組脂肪蓄積嚴重，LGLT組、JLDL組、JLDM組、JLDH組脂肪蓄積均有不同程度的減輕。見Fig 1。

2.4 骨骼肌 INSR、IRS-1、LDLR和 SCAP mRNA水平比較 與NF組比較，HF組骨骼肌INSR、IRS-1、LDLR mRNA水平均明顯低于NF組（P＜0.05），SCAP mRNA水平明顯高于NF組；與HF組比較，LGLT、JLDM、JLDH組 INSR、IRS-1 mRNA水平明顯上升（P＜0.05）；JLDL、JLDM、JLDH組 LDLR mRNA水平均明顯升高 （P＜0.05）；LGLT、JLDM、JLDH組SCAP mRNA水平明顯下降（P＜0.05）。見Tab 3。

Tab 3 Effects of JLD on INSR，IRS-1，LDLR and SCAP mRNA expression（±s，n＝3）

Tab 3 Effects of JLD on INSR，IRS-1，LDLR and SCAP mRNA expression（±s，n＝3）

＃P＜0.05 vs NFgroup；*P＜0.05 vs HFgroup

Group INSR IRS-1 LDLR SCAP NF 1.04±0.18 1.03±0.14 1.00±0.14 0.91±0.17 HF 0.26±0.04＃ 0.33±0.04＃ 0.36±0.05＃ 2.91±0.54＃LGLT 0.79±0.14* 0.94±0.13* 0.33±0.05 2.31±0.42*JLDL 0.31±0.06 0.36±0.06 0.65±0.10* 2.77±0.21 JLDM 0.49±0.09* 0.75±0.12* 0.66±0.09* 1.48±0.21*JLDH 0.60±0.10* 0.88±0.13* 0.60±0.08* 1.38±0.13*

2.5 骨骼肌 INSR、IRS-1、LDLR和 SCAP蛋白表達比較 與NF組相比，HF組INSR、IRS-1、LDLR、SCAP蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與HF組相比，LGLT、JLDL、JLDM、JLDH組 INSR蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；LGLT、JLDM、JLDH的IRS-1的蛋白表達明顯升高；JLDM、JLDH組LDLR蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；而 JLDL、JLDM、JLDH組SCAP蛋白表達則明顯降低（P＜0.05），見Tab 4、Fig 2。

Tab 4 Effects of JLD on INSR，IRS-1，LDLR and SCAP protein expression（±s，n＝3）

Tab 4 Effects of JLD on INSR，IRS-1，LDLR and SCAP protein expression（±s，n＝3）

＃P＜0.05 vs NFgroup；*P＜0.05 vs HFgroup

Group INSR IRS-1 LDLR SCAP NF 1.12±0.10 1.23±0.13 0.70±0.10 0.17±0.01 HF 0.34±0.04＃ 0.60±0.01＃ 0.47±0.02＃ 0.80±0.10＃LGLT 0.75±0.07* 0.99±0.13* 0.44±0.06 0.73±0.11 JLDL 0.49±0.03* 0.66±0.07 0.49±0.04 0.48±0.08*JLDM 0.60±0.05* 0.83±0.08* 0.70±0.13* 0.44±0.07*JLDH 0.84±0.06* 1.03±0.08* 0.83±0.15* 0.29±0.05*

Fig 1 Oil red O staining of skeletal muscle（400×）

3 討論

IR是引起許多代謝疾病如動脈粥樣硬化、T2DM的共同病理、生理基礎，研究IR的發(fā)生、發(fā)展過程對于人類深入探究代謝綜合征具有深遠的意義。骨骼肌是胰島素的重要代謝場所，骨骼肌可以處置餐后70%～90%的葡萄糖［4］，現(xiàn)在普遍認為，骨骼肌細胞內的脂質含量過多是IR的一個重要因素。血液中的游離脂肪酸水平升高，以至于過多的游離脂肪酸游離到組織內，導致脂肪組織難以容納和儲存過多的脂肪酸，使脂質在骨骼肌內堆積，擾亂正常的組織能量代謝，進而產(chǎn)生了骨骼肌的胰島素抵抗［5］。

ApoE－／－小鼠對于富含膽固醇的脂蛋白的清除有障礙，會導致高膽固醇血癥［5］。本實驗經(jīng)過高脂飲食誘導的 ApoE－／－小鼠，TC、TG、FINS、FBG均明顯升高，胰島素敏感指數(shù)降低，表明其發(fā)生了明顯的胰島素抵抗。因此，長期高脂誘導的ApoE－／－小鼠可以作為一種很好的與人類致病因素比較相近的IR模型來探究IR［6］。我們也觀察到長期高脂誘導的ApoE－／－小鼠，血脂水平明顯升高，骨骼肌脂肪蓄積嚴重，而津力達組卻有不同程度的改善，津力達能夠降低血脂，提高胰島素敏感程度，不同程度改善骨骼肌組織內的脂肪蓄積。

Fig 2 Protein expression of INSR，IRS-1，LDLR and SCAP in skeletal muscle1：NF；2：HF；3：LGLT；4：JLDL；5：JLDM；6：JLDH

為了進一步了解津力達在骨骼肌IR形成和發(fā)展過程的作用，及其與膽固醇代謝相關因素的關系，我們檢測了小鼠骨骼肌INSR、IRS-1和兩個關鍵的膽固醇的調控基因LDLR和SCAP的蛋白和mRNA的表達。胰島素抵抗的發(fā)生多由于先天、環(huán)境等因素而引起胰島素受體和受體后的缺陷所導致［7］。文獻報道，胰島素分泌以后，經(jīng)過自身的血液循環(huán)到達靶細胞，與細胞表面的INSR相結合，經(jīng)過一系列的去磷酸化和磷酸化的過程，激活多種激酶，活化IRS-1，然后再完成各種級聯(lián)效應［8］，促進葡萄糖轉運蛋白向細胞膜轉位，完成組織的葡萄糖轉運，調節(jié)外周的葡萄糖代謝。這一過程的任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生問題，都將會影響胰島素信號的傳導，主要包括INSR的活性下降、葡萄糖轉運減少、糖原合成酶活性降低、胰島素信號轉導異常等。本實驗中，經(jīng)過長期高脂誘導的ApoE－／－小鼠的胰島素抵抗程度嚴重，實驗結果發(fā)現(xiàn)，模型組INSR和IRS-1的水平明顯降低，可能由于INSR或IRS-1的水平降低而產(chǎn)生IR，或者在IR的狀態(tài)下，導致信號通路等因素發(fā)生改變，而使INSR和IRS-1產(chǎn)生不同程度的下降，進而使IR加重。津力達能上調INSR和IRS-1水平，提示津力達可能通過上調小鼠骨骼肌INSR和IRS-1表達，使小鼠胰島素的敏感性上升，從而減輕小鼠的胰島素抵抗程度。

LDLR是位于細胞表面的跨膜受體，主要功能是結合LDL或者其他載脂蛋白B100和載脂蛋白E（ApoE）的脂蛋白［9］。ApoE是血漿脂蛋白的重要成分，對體內膽固醇代謝和脂蛋白的分解起到關鍵作用。ApoE基因的缺失會引起LDL的代謝障礙，出現(xiàn)動脈粥樣硬化病灶和高脂血癥［10］。本實驗采用ApoE基因敲除小鼠，ApoE基因缺失使得LDL代謝紊亂，進而引起LDLR的清除作用降低，使結合的LDLR的含量降低。為了維持膽固醇的恒定水平，膽固醇的攝入和合成有一系列的調節(jié)因子調控，包括膜結合轉錄因子膽固醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBPs）和SREBP裂解激活蛋白（SCAP）等調控。目前，SCAP被認為是哺乳動物的脂質合成以及攝入的中心調節(jié)因子［11］。在機體的其他因素或者低膽固醇的情況下，SCAP和 SREBPs結合成為SREBP-SCAP復合物。該復合物被轉運至高爾基體，隨后在位點1蛋白酶和位點2蛋白酶依次裂解后，形成成熟的SREBPs片段進入細胞核，與SRE結合，從而促進相關基因的轉錄，使膽固醇的合成增強。在相關輔助因子的作用下，激活膽固醇和脂肪酸代謝基因的轉錄，從而增加細胞對外源性膽固醇的攝取和細胞內源性膽固醇的合成［12］。本研究中模型組SCAP表達升高，LDLR表達降低，津力達治療后，可下調SCAP水平，從而抑制SREBPs的活化，下調膽固醇和脂肪酸代謝基因的表達，減少骨骼肌脂質的合成和攝??；同時，升高LDLR表達，提高膽固醇清除功能，調控骨骼肌代謝趨于正常，改善小鼠骨骼肌的胰島素抵抗。

綜上所述，經(jīng)過長期高脂誘導的ApoE－／－小鼠是很好的胰島素抵抗模型，津力達能夠通過調節(jié)小鼠骨骼肌膽固醇代謝，改善胰島素抵抗，但其具體機制還需進一步深入的研究。

參考文獻：

［1］ Kwak M K，Ha H.Where are we now in diabetic research［J］.Arch Pharm Res，2013，36（2）：142－4.

［2］ 姜兆順，趙建芹，劉元濤.脂肪因子與骨骼肌胰島素抵抗研究進展［J］.山東醫(yī)藥，2010，50（17）：112－3.

［2］ Jiang Z S，Zhao J Q，Liu Y T.Adipokines and insulin resistance in skeletal muscle progress［J］.Shandong Med J，2010，50（17）：112－3.

［3］ 張 妍，畢會民，甘佩珍.葛根素對胰島素抵抗大鼠骨骼肌中蛋白激酶B表達影響［J］.中國藥理學通報，2004，20（3）：307－10.

［3］ Zhang Y，Bi H M，Gan P Z.Puerarin resistance in rat skeletal muscle protein kinase B expression on insulin［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20（3）：307－10.

［4］ Pedersen BK，F(xiàn)ebbraio M A.Muscles，exercise and obesity：skeletal muscle as a secretory organ［J］.Nature Rev Endocrinol，2012，8（8）：457－65.

［5］ 肖方喜，孫 暉，陳璐璐.高脂喂養(yǎng)誘導大鼠骨骼肌胰島素抵抗的機制研究［J］.華中科技大學學報：醫(yī)學版，2008，37（3）：309－11.

［5］ Xiao FX，Sun H，Chen L L.Mechanisms of high－fat fed rats induced insulin resistancein skeletal muscle［J］.Acta Med Univ Sci Technol Huazhong，2008，37（3）：309－11.

［6］ Phillips JW，Barringhaus K G，Sanders JM，et al.Rosiglitazone reduces the accelerated neointima formation after arterial injury in a mouse injury model of type 2 diabetes［J］.Circulation，2003，108（16）：1994－9.

［7］ Saltiel A R，Kahn C R.Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism［J］.Nature，2001，414（6865）：799－806.

［8］ 劉雪芹，于 湄，張 燕，魏麗莉.蟲草多糖對2型糖尿病小鼠 InsR／IRS-1通路及糖代謝的影響［J］.中國藥師，2011，14（2）：163－6.

［8］ Liu X Q，Yu M，Zhang Y，Wei L L.Pathways and effects of Cordyceps polysaccharide type2 diabetic mice InsR／IRS-1 glucose metabolism［J］.China Pharm，2011，14（2）：163－6.

［9］ 陳 芬，王綠婭，尹衛(wèi)東.低密度脂蛋白受體功能及其影響因素研究進展［J］.中國動脈硬化雜志，2006，14（5）：448－50.

［9］ Chen F，Wang L Y，Yin WD.LDL receptor function and its influencing factors progress［J］.Chin J Arterioscler，2006，14（5）：448－50.

［10］Mortimer B C，Redgrave T G，Spangler E A，et al.Effect of human apoE4 on the clearance of chylomicron-like lipid emulsions and atherogenesis in transgenic mice［J］.Arterioscler Thromb，1994，14（10）：1542－52.

［11］劉 芳，周 新.SCAP與膽固醇水平的調節(jié)機制［J］.生命科學，2002，14（3）：146－9.

［11］Liu F，Zhou X.SCAP and cholesterol levels adjustment mechanism［J］.Chin Bull Life Sci，2002，14（3）：146－9.

［12］Yokoyama C，Wang X，Briggs M R，et al.SREBP-1，a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene［J］.Cell，1993，75（1）：187－97.