郭 濤，趙龍山，程 佳，，夏東亞，曾 平，肖 勇，趙東祥，李 強(qiáng)，白 音，楊長(zhǎng)青

（1.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院藥劑科，新疆烏魯木齊 830000；4.解放軍第五醫(yī)院藥劑科，寧夏 銀川 750004；5.解放軍第313醫(yī)院赤峰臨床部，內(nèi)蒙古赤峰 024006；6.赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)部，內(nèi)蒙古赤峰 024000；7.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉 133002）

多沙普侖（doxapram）為非特異性呼吸興奮藥，主要通過(guò)直接興奮延髓呼吸中樞、外周化學(xué)感受器及加強(qiáng)膈肌活動(dòng)，使患者潮氣量增加，呼吸頻率變快，有效拮抗全麻后阿片類藥物引起的呼吸抑制。本品系臨床必備急救藥，常用于全麻術(shù)后催醒和呼吸衰竭搶救［1－2］。目前，除本課題組前期報(bào)道外［3－4］，尚未見到國(guó)內(nèi)有關(guān)本品在中國(guó)多民族人體藥代動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道。中國(guó)是一個(gè)多民族國(guó)家，各民族生活環(huán)境、飲食習(xí)慣以及遺傳因素的不同，可能會(huì)導(dǎo)致同一藥物在不同民族受試者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程出現(xiàn)差異。本文以漢族、蒙古族、朝鮮族、維吾爾族和回族健康受試者為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法測(cè)定多沙普侖的血漿濃度，研究并比較多沙普侖在不同民族健康受試者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，為戰(zhàn)、創(chuàng)傷及平時(shí)臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀，包括Waters 600型四元泵、Waters 2487型紫外檢測(cè)器（美國(guó) Waters公司）；N-2000色譜工作站（浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司）；KQ3200DE型超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；TGL型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；YKH-2型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）；AEL-160電子分析天平（日本島津制作所）。

1.2 藥品與試劑 多沙普侖對(duì)照品（含量：98.5%，批號(hào)：0068－9701，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；內(nèi)標(biāo)：非那西丁對(duì)照品（含量：99%，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；鹽酸多沙普侖注射液（規(guī)格：0.1 g／5 ml，批號(hào)：20090103，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純?？瞻兹搜獫{（沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院輸血科提供）。

1.3 受試者選擇 選擇漢族、蒙古族、朝鮮族、維吾爾族和回族健康受試者50名（每個(gè)民族10人，男女各半），其父母、祖父母、外祖父母3代均為同族婚配。所有受試者試驗(yàn)前均進(jìn)行體檢和血液生化檢查，檢查結(jié)果顯示受試者心、肝、腎功能未見異常，無(wú)過(guò)敏史，家族無(wú)精神病史，試驗(yàn)前兩周內(nèi)未服用任何其他藥物，試驗(yàn)期間禁煙、酒及含咖啡飲料等。受試者試驗(yàn)前簽署書面知情同意書。受試者的基本情況見Tab 1。

1.4 給藥方案及藥品采集 試驗(yàn)方案經(jīng)沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采用單劑量靜脈滴注給藥。受試者試驗(yàn)前1 d進(jìn)食清淡晚餐后禁食12 h，試驗(yàn)當(dāng)日清晨，將50 mg鹽酸多沙普侖注射液注入到100 ml 0.9%氯化鈉溶液中后開始滴注，恒速滴注時(shí)間為30 min，給藥后受試者避免劇烈活動(dòng)；4、10 h進(jìn)食統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。

受試者于給藥前0 h、靜脈滴注給藥后15、30、35、45 min，1、1.5、2.5、3.5、4.5、6.5、8.5、12.5 h分別取前臂靜脈血4.0 ml，置于肝素抗凝管中，離心取上清血漿，－20℃凍存，待測(cè)。

Tab 1 Demographic background of subjects for modeling

1.5 測(cè)定條件 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇 －乙腈 －0.01 mol·L－1磷酸二氫銨緩沖液 （pH 4.5）－（30∶14∶56）；流速：1.3 ml·min－1；柱溫：室溫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；進(jìn)樣量：20μl。

1.6 樣品測(cè)定

1.6.1 對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取多沙普侖對(duì)照品10.00 mg，置于10 ml量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，使成1 mg·L－1的對(duì)照品溶液，－4℃保存?zhèn)溆?。另精密稱取非那西汀對(duì)照品10.00 mg，置于10 ml量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，使成1 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用時(shí)取儲(chǔ)備液1 ml，置于100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，制成10 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)工作溶液，－4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 血漿樣品預(yù)處理 取血漿0.5 ml，置于具塞玻璃試管中，加水50μl，然后加入 10 mg·L－1的非那西汀50μl，渦旋30 s，加入 pH 9.0緩沖液500 μl，然后加入 3 ml乙酸乙酯，渦旋 1 min，4 000 r·min－1離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一試管，于40℃氮?dú)饬鞔蹈?，加?00μl流動(dòng)相復(fù)溶，20μl進(jìn)樣。

1.6.3 質(zhì)控樣品 每批血漿樣品測(cè)定時(shí)均建立新的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)，隨行多沙普侖濃度分別為0.1、0.5和4.0 mg·L－1的低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，并均勻分布在未知樣品的測(cè)試序列中，以判斷每批樣品測(cè)定結(jié)果的可靠性。本法測(cè)定結(jié)果RE均＜15%，符合生物樣品測(cè)定要求。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用DAS2.0藥動(dòng)學(xué)軟件對(duì)血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，根據(jù)AIC值確定藥動(dòng)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)計(jì)算。受試者的Cmax、Tmax以實(shí)測(cè)值求得，AUC以梯形法計(jì)算。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。首先，對(duì)各民族受試者的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，然后，對(duì)符合正態(tài)分布和方差齊性的參數(shù)進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)，再采用S-N-K法對(duì)存在民族差異的參數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，進(jìn)一步確定差異存在于哪些民族之間。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 專屬性 在上述色譜條件下，空白血漿、空白血漿加多沙普侖對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)、受試者用藥后血漿樣品的色譜圖見Fig 1。由圖可見，內(nèi)標(biāo)非那西丁與多沙普侖的保留時(shí)間分別為7.4 min和13.6 min，兩者分離良好，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定。

Fig 1 HPLC chromatograms of doxapramA：Blank plasma；B：Blank plasma spiked with doxapramand internal standard；C：Han volunteer plasma sample；D：Mengolia volunteer plasma sample；E：Korean volunteer plasma sample；F：Hui volunteer plasma sample；G：Uigur volunteer plasma sample.1：IS；2：doxapram

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在空白血漿中加入不同量的多沙普侖對(duì)照品溶液，配制成多沙普侖濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg· L－1的血漿樣品，按上述血漿樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析。以多沙普侖濃度C為橫坐標(biāo)，多沙普侖與內(nèi)標(biāo)的峰面積比Y為縱坐標(biāo)，選擇權(quán)重為1／c2，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸，得回歸方程為：＾Y＝1.264 C－0.003，r＝0.999。定量下限為0.05 mg·L－1（n＝6，RSD＜10%）。

2.1.3 回收率與精密度 在空白血漿中加入多沙普侖對(duì)照品溶液適量，配制成濃度分別為0.1、0.5和4.0 mg·L－1的低、中、高3種濃度的血漿質(zhì)控樣品各5份，按血漿樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析，計(jì)算測(cè)得量與加入量的比值，求得方法回收率。另將測(cè)得的血漿質(zhì)控樣品的峰面積與多沙普侖對(duì)照品溶液用流動(dòng)相稀釋后直接進(jìn)樣測(cè)得的峰面積比較，計(jì)算提取回收率。同法配制0.1、0.5和4.0 mg·L－1的低、中、高3個(gè)濃度的血漿質(zhì)控樣品，按血漿樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析，測(cè)定日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果見Tab 2。

Tab 2 Recovery and precision of doxapram（±s，n＝5）

Tab 2 Recovery and precision of doxapram（±s，n＝5）

Concentration／mg· L－1 Relative recovery／%Absolute recovery／%Within-day RSD／%Between-day RSD／%0.1 110.7±7.2 64.0±3.5 6.49 8.69 0.5 100.0±3.7 60.6±6.5 3.73 13.40 4.0 111.3±2.9 60.7±1.1 2.64 6.50

2.1.4 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 配制多沙普侖濃度分別為0.1、0.5和4.0 mg· L－1的質(zhì)控血漿樣品，分別在室溫放置8 h，－25℃凍融3次；－25℃冰凍存放30 d，進(jìn)行樣品穩(wěn)定性考察。結(jié)果3個(gè)濃度血漿樣品的多沙普侖濃度偏移均小于±5%，測(cè)定RSD均小于10.3%。

2.2 血藥濃度－時(shí)間曲線 50名健康受試者靜脈滴注多沙普侖50 mg后的平均藥－時(shí)曲線見Fig 2。由Fig 2可見，靜脈滴注給藥期間，多沙普侖血藥濃度逐漸升高，停滴后，多沙普侖血藥濃度有一較快下降的過(guò)程，而后消除減慢，經(jīng)模型確定符合靜脈滴注二室模型。

Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of doxapram in healthy subjects of five ethnic groups after intravenous infusion of 50 mg doxapram（±s，n＝10）

Tab 3 The pharmacokinetic parameters of doxapram in healthy subjects±s，n＝10）

Tab 3 The pharmacokinetic parameters of doxapram in healthy subjects±s，n＝10）

Parameter Han Mongolian Korean Hui Uigur T1／2α／h 0.33±0.24 0.51±0.39 0.39±0.27 0.39±0.27 0.49±0.42 T1／2β／h 3.87±2.17 4.30±3.20 4.06±3.06 3.91±2.05 3.65±2.07 V c／L·kg－1 0.35±0.20 0.60±0.35 0.34±0.15 0.42±0.11 0.79±0.53 V d／L·kg－1 1.35±0.96 1.80±0.85 1.53±1.19 1.34±0.45 1.81±0.99 CL／L·h－1·kg－1 0.25±0.11 0.33±0.11 0.27±0.07 0.26±0.06 0.39±0.25 AUC0－12.5／mg·h·L－1 3.51±1.26 2.47±0.80 2.64±0.46 3.02±0.56 2.32±0.70 AUC0－∞／mg·h·L－1 4.06±1.44 2.89±1.06 3.01±0.63 3.49±0.73 2.68±0.80 C max／mg·L－1 1.55±0.52 1.02±0.30 1.31±0.47 1.48±0.46 0.99±0.35

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 五個(gè)民族健康受試者靜脈滴注多沙普侖50 mg后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見Tab 3，不同性別間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見Tab 4。

Tab 4 Comparison of pharmacokinetic parameters between male and female subjects（±s，n＝5）

Tab 4 Comparison of pharmacokinetic parameters between male and female subjects（±s，n＝5）

Parameter Male Female T1／2α／h 0.41±0.32 0.43±0.32 T1／2β／h 3.54±1.93 4.37±2.89 V c／L·kg－1 0.42±0.27 0.58±0.40 V d／L·kg－1 1.28±0.72 1.85±0.99 CL／L·h－1·kg－1 0.25±0.08 0.35±0.18 AUC0－12.5／mg·h·L－1 2.91±0.87 2.67±0.90 AUC0－∞ ／mg·h·L－1 3.29±1.03 3.16±1.11 C max／mg·L－11.35±0.46 1.20±0.48

2.4 安全性評(píng)價(jià) 50名受試者在靜脈滴注鹽酸多沙普侖注射液過(guò)程中，多數(shù)人主訴身體發(fā)熱，滴注結(jié)束后緩解。

3 討論

本研究建立的高效液相色譜法對(duì)多沙普侖、內(nèi)標(biāo)與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)可得到較好的分離效果及合適的保留時(shí)間。簡(jiǎn)便、快速，同時(shí)，方法學(xué)確證指標(biāo)符合臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求。每批血漿樣品測(cè)定時(shí)均建立新的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)，隨行多沙普侖濃度分別為 0.1、0.5、4.0 mg· L－1的低、中、高3個(gè)濃度的雙質(zhì)控樣品，并均勻分布在未知樣品的測(cè)試順序中，測(cè)定結(jié)果均符合生物樣品測(cè)定的要求。

多沙普侖的藥動(dòng)學(xué)研究，除本課題組的報(bào)道外，國(guó)內(nèi)未見其它文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，多沙普侖在中國(guó)五民族人群的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程符合二室模型，與文獻(xiàn)報(bào)道的接近［5］。其代謝產(chǎn)物為活性的多沙普侖酮，因無(wú)對(duì)照品，故未對(duì)其藥動(dòng)學(xué)過(guò)程進(jìn)行研究。

多沙普侖在健康人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程五民族間差異不一［6－7］，數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示漢族受試者的 AUC0－12.5、AUC0－∞和 Cmax明顯高于維吾爾族和蒙古族（P＜0.05），其他藥動(dòng)學(xué)參數(shù)五民族間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其原因可能是維吾爾族和蒙古族肝臟藥物代謝酶不同所致，提示臨床應(yīng)用本品時(shí)應(yīng)予以注意。

性別差異可能會(huì)影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄［8］，為此，我們按性別分組，采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，經(jīng)體重校正后，比較了多沙普侖的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，男性與女性的Vc、Vd和CL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。文獻(xiàn)報(bào)道［9］，多沙普侖的快速消除是由于多沙普侖快速?gòu)难獫{中分布到其他組織中，如大腦、骨骼肌和脂肪等；另外，多沙普侖的表觀分布容積大于人總體液容積0.6 L·kg－1，也說(shuō)明多沙普侖分布到除體液外的組織中。男女受試者生理結(jié)構(gòu)有一定的區(qū)別，一般來(lái)說(shuō)，女性受試者的脂肪相對(duì)較多，這可能是造成女性受試者的表觀分布容積較大的原因。文獻(xiàn)報(bào)道［10－11］，藥物代謝存在性別差異的原因有很多，生理因素包括體質(zhì)量、組織大小、腎小球?yàn)V過(guò)率和腸動(dòng)力等；分子水平包括藥物代謝酶等。另有文獻(xiàn)報(bào)道［12］，藥物代謝方面的性別差異與雌激素有關(guān)。

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