金世云，何淑芳，吳 昊，朱海娟，張書杰，張 野

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.麻醉科、2.超聲科，安徽 合肥 230601）

慢性心力衰竭是各種心臟疾病發(fā)展的終末階段，這類患者在行心血管手術(shù)時更易發(fā)生心臟的缺血／再灌注損傷（ischemia／reperfusion injury，IRI），可能導(dǎo)致術(shù)后并發(fā)癥和死亡率增加［1］。因此，尋找一種有效減輕心力衰竭心肌缺血／再灌注損傷的心肌保護(hù)策略，在臨床上具有重要的理論和實際意義。缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IPC）是迄今為止最強(qiáng)的內(nèi)源性心肌保護(hù)方法，但近年研究表明，在高血糖、高血脂、心肌梗死等病理狀態(tài)下，心肌對IPC的敏感性減弱或消失［2］。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，IPC對心力衰竭心臟的保護(hù)作用明顯減弱，但阿片類藥物如嗎啡、瑞芬太尼預(yù)處理仍能發(fā)揮心肌保護(hù)作用［3－4］，其機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路，主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal protein kinase，JNK）、p38激酶3個亞族，在阿片類藥物介導(dǎo)正常大鼠的心肌保護(hù)中發(fā)揮重要作用［5］。本研究擬利用阿霉素長期注射誘導(dǎo)的大鼠慢性心力衰竭模型，探討MAPK信號通路在瑞芬太尼預(yù)處理（remifentanil preconditioning，RPC）減輕心力衰竭大鼠離體心臟缺血／再灌注損傷中的作用，將為阿片預(yù)處理用于臨床預(yù)防心力衰竭心臟缺血／再灌注損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑與儀器 鹽酸阿霉素（批號：2QL0061，Prizer公司，意大利），鹽酸瑞芬太尼（批號：6130311，宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司），伊文斯蘭（批號：20110909024，北京綠生源有限公司），氯化三苯基四氮唑（TTC，批號：129K1867V，Sigma公司，美國），乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），ERK抑制劑PD98059、p38抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125（均購自 Cell Signaling公司），Power Lab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（AD公司，澳大利亞），Langendorff灌注系統(tǒng)（安徽淮北正華有限責(zé)任公司），Vivid 7.0彩色超聲儀（GE公司，美國）。

1.2 動物模型制備與分組處理 健康♂SD大鼠，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（皖）2005－001，體質(zhì)量 200～230 g，參照文獻(xiàn)［6］介紹的方法制備慢性心力衰竭模型，于第8周末通過Vivid 7.0彩色超聲儀評價大鼠心功能。將模型制備成功的慢性心力衰竭大鼠，通過隨機(jī)數(shù)字表分為9組（n＝6）：假手術(shù)組（sham）、缺血／再灌注組（IR）、瑞芬太尼預(yù)處理組（RPC）、ERK抑制劑PD98059＋RPC組（RPD）、p38抑制劑 SB203580＋RPC組（RSB）、JNK抑制劑 SP600125＋RPC組（RSP）以及抑制劑對照組（PD、SB和SP）。大鼠斷頭，取出心臟放在預(yù)先準(zhǔn)備的4℃K-H液中，立即懸掛于Langendorff灌注架，逆行恒壓灌注，灌注液為K-H 液 （118.5 NaCl，4.7 KCl，1.2 MgSO4，1.2 KH2PO4，2.5 CaCl2，25.0 NaHCO3，11.0 Glucose，單位為 mmol·L－1）。用體積分?jǐn)?shù)為95%的O2與5%的CO2的混合氣進(jìn)行平衡，維持灌注液的pH值在7.4左右，溫度穩(wěn)定于37℃。用6-0絲線在肺動脈圓錐與左心耳之間縫扎左前降支起始部位，左心耳處剪一小口，將乳膠水囊自該小口置入左心室內(nèi)，連接Power Lab系統(tǒng)，調(diào)節(jié)水囊內(nèi)的容積，維持左心室舒張末壓在0～1.33 kPa之間。實驗中，通過收緊線結(jié)，實現(xiàn)左前降支支配區(qū)域心肌缺血與再灌注，缺血時表現(xiàn)為：缺血區(qū)域發(fā)紺、冠脈流量下降及LVDP減小。全部操作完成后，心臟穩(wěn)定15 min，有明顯心律失常以及LVDP＜12 kPa的心臟棄之不用。Sham組僅縫線不結(jié)扎，持續(xù)灌注。IR組在平衡后，給予結(jié)扎左前降支30 min，松開線結(jié)后再灌注120 min。RPC組在平衡后，行5 min瑞芬太尼預(yù)處理（50μg·L－1），間隔 5 min，共 3個循環(huán)，然后缺血 30min，再灌注 120 min。RPD、RSB、RSP組在RPC預(yù)處理前10 min分別給予溶有ERK抑制劑PD98059（10μmol·L－1）、p38抑制劑 SB203580（5 μmol·L－1）或 JNK抑制劑 SP600125（5μmol·L－1）的K-H液灌流，直至缺血開始后5 min，共45 min。抑制劑對照PD組、SB組及SP組在IR前僅給予各抑制劑，不進(jìn)行瑞芬太尼預(yù)處理。

1.3 LDH檢測 所有組收取平衡15 min后（baseline）、再灌注后5 min（P5）及10 min（P10）的冠脈流出液，化學(xué)比色法檢測LDH活性。

1.4 心肌梗死面積檢測 再灌注末，取下大鼠心臟，吸干表面水份，稱量，記錄心臟濕重。取下大鼠心臟后，再次結(jié)扎左前降支，用0.25%的伊文斯蘭通過主動脈逆行灌注對心臟進(jìn)行染色，非缺血區(qū)心肌藍(lán)染，缺血區(qū)無藍(lán)染，放于－80℃冰箱20 min左右，行冰凍切片，沿心臟縱軸線切5～6片，每片為2 mm。切片在1%TTC溶液中，37℃中孵育10～15 min，隨后再用10%中性福爾馬林液固定過夜，梗死區(qū)（IS）呈白色，缺血危險區(qū)（AAR）呈磚紅色。通過Imaging J 1.38e圖像分析軟件計算左心室與右心室總體積（LV＋RV）、AAR體積，IS體積及 IS／AAR的比值。

1.5 心功能指標(biāo)檢測 通過Power Lab系統(tǒng)分別記錄各組平衡 15 min（baseline）、預(yù)處理結(jié)束后（treatment）、缺血 30 min末（ischemia）、再灌注 60 min（P60）及再灌注120 min（P120）時心率（HR）、左心室發(fā)展壓（LVDP）、左心室壓力最大上升速率（＋d p／d tmax）、左心室壓力下降最大速率（－d p／d tmax）及冠脈流出液（CF）5種血流動力學(xué)指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 冠脈流出液中LDH活性 再灌注5 min和10 min時，與sham組LDH活性相比（5 min：77±10，10 min：76±11），IR組 LDH活性明顯升高（5 min：278±31，10 min：203±32；P＜0.01）。而 RPC可以明顯降低再灌注5 min和10 min的LDH活性（5 min：203±33，P＜0.01；10 min：162±16，P＜0.05）。再灌注5 min時，JNK抑制劑SP600125可明顯阻斷RPC降低LDH活性的作用（265±32，P＜0.01）；ERK抑制劑PD98059也有部分阻斷作用（238±24，P＜0.05）；而p38抑制劑SB203580有升高LDH活性的趨勢，但與RPC相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PD、SB、SP組在再灌注5 min和10 min時的LDH活性與sham組相比，差異有顯著性，而與IR組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組基礎(chǔ)LDH活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（單位：IU·L－1）。見 Fig 1。

2.2 心肌梗死面積 與sham組（0.08±0.03）相比，IR組的 IS／AAR明顯增加至（0.50±0.10），P＜0.01；RPC則可以明顯減輕IR損傷，IS／AAR降低到（0.23±0.08），P＜0.01，這提示 RPC可以發(fā)揮心肌保護(hù)作用。與RPC相比，RSP和RPD的IS／AAR明顯增加（RPD：0.36±0.09，P＜0.05；RSP：0.48±0.12，P＜0.01），而 RSB的無明顯增加（0.30±0.04，P＜0.01），這提示 JNK信號通路抑制劑和ERK通路抑制劑可以完全或部分阻斷RPC的心肌保護(hù)作用。PD、SB、SP組IS／AAR與sham組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而與IR組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組在心重、LV＋RV及AAR上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見Fig 2。

Fig 1 LDH activity in coronary effluent in each group（±s，n＝6）1：Sham；2：IR；3：RPC；4：RPD；5：RSB；6：RSP；7：PD；8：SB；9：SP.The LDH activity was detected at baseline，5 min and 10 min after reperfusion（P5 and P10），respectively.*P＜0.05，**P＜0.01 vs IR group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs RPC group；＃＃P＜0.01 vs sham group.

Fig 2 Infarct size determined by TTC staining in each groupA：Infarct size expressed as a percentage of the area at risk in groups subjected to RPC in the absence or presence of MPAK inhibitors；1：Sham；2：IR；3：RPC；4：RPD；5：RSB；6：RSP；7：PD；8：SB；9：SP.*P＜0.05，**P＜0.01 vs IR group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs RPCgroup；＃＃P＜0.01 vs sham group.B：Representative images of AAR showing viable tissue（red）and infarcted tissue（white）for experimental groups.

2.3 血流動力學(xué)變化 I／R組在缺血30 min末、再灌注60 min及120 min 3個時間點上，LVDP、HR、＋d p／d tmax、－d p／d tmax4個指標(biāo)與 sham組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明缺血／再灌注損傷導(dǎo)致心臟功能的下降。除sham組外，其余各組間血流動力學(xué)差異無顯著性，這提示瑞芬太尼預(yù)處理對離體心臟功能沒有明顯改善作用。見Tab 1。

3 討論

瑞芬太尼是臨床麻醉中常用的新型阿片類鎮(zhèn)痛藥，主要是μ-阿片受體激動劑，同時，對δ、κ受體也有一定激動作用。我們前期研究表明，瑞芬太尼預(yù)處理不僅可以抗正常大鼠心臟缺血／再灌注損傷，還可以明顯減輕慢性心力衰竭大鼠的心肌缺血后損傷［3，7］。本實驗根據(jù)前期研究方法成功建立慢性心力衰竭和離體心臟缺血／再灌注損傷模型［3，6］，并選擇濃度為50μg·L－1的瑞芬太尼進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示，RPC明顯縮小缺血后心肌梗死面積，并降低再灌注5 min和10 min時的LDH活性，證實RPC可以減輕心肌IR損傷，對心力衰竭大鼠心臟產(chǎn)生保護(hù)作用。

阿片類藥物預(yù)處理主要是通過激活心臟上的阿片受體，繼而活化下游的多種蛋白激酶，包括蛋白激酶 C（PKC）、PI3K／Akt（磷脂酰肌醇-3-激酶／蛋白激酶）、MAPK等，經(jīng)過蛋白磷酸化作用激活線粒體KATP通道，從而對心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。本研究利用3種MAPK信號通路抑制劑，進(jìn)一步探討MAPK信號通路在RPC介導(dǎo)心衰大鼠心肌保護(hù)中的作用。在RPC開始前10 min應(yīng)用JNK通路抑制劑SP600125、ERK通路抑制劑PD98059或p38通路抑制劑 SB203580，結(jié)果 SP600125幾乎完全阻斷了RPC的心肌保護(hù)作用，PD98059有部分阻斷作用，而SB203580對RPC心肌保護(hù)作用無明顯影響，提示RPC介導(dǎo)心力衰竭大鼠的心肌保護(hù)作用與預(yù)處理階段JNK和ERK信號通路的活化有關(guān)。

既往研究表明，心肌缺血／再灌注或預(yù)處理過程均可能導(dǎo)致MAPK信號通路活化，其中，ERK通路活化大多被認(rèn)為對心臟起保護(hù)作用，其活化可以依賴或不依賴于 PI3K／Akt信號通路［8－9］。然而，JNK和p38通路是否介導(dǎo)心臟保護(hù)作用仍存在爭議，不同的研究認(rèn)為這兩條通路的活化可能產(chǎn)生心臟保護(hù)作用，也可能對心臟有害［10］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，RPC對正常大鼠在體心臟缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用與 JNK和 p38通路活化有關(guān)［11－12］。然而，本研究中RPC發(fā)揮對心力衰竭大鼠的心肌保護(hù)作用，主要依賴JNK通路活化，其次是ERK通路，而與p38通路無明顯關(guān)系。當(dāng)心臟發(fā)生病理性改變時，某些蛋白激酶信號途徑可能發(fā)生改變。Miki等［13］研究發(fā)現(xiàn)，梗死后心肌重構(gòu)導(dǎo)致PI3K／Akt信號通路失活，而代償性ERK通路激活有利于心肌保護(hù)。在糖尿病大鼠模型中，PI3K及ERK等信號通路改變，可能導(dǎo)致嗎啡預(yù)處理的心肌保護(hù)作用消失［14］。Peart等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在老年小鼠心臟中，阿片受體激動劑由于不能激活p38通路，導(dǎo)致其心肌保護(hù)作用消失。在心力衰竭情況下，ERK、JNK及p38信號通路活化狀態(tài)發(fā)生異常改變［16］，這可能導(dǎo)致RPC介導(dǎo)心力衰竭大鼠心肌保護(hù)中涉及的MAPK通路與正常情況下有所不同，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。

Tab 1 Hemodynamic parameters in each group（ˉ±s，n＝6）

Tab 1 Hemodynamic parameters in each group（ˉ±s，n＝6）

＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs sham group

－d p／d t max／kPa·s－1 CF／ml·min－1 179±33 192±55 162±45 149±45 176±24 129±11 72±15＃91±41 102±26 90±20 110±29 119±29 90±17 100±18 6.3±3.0 5.3±2.3 6.2±1.6 3.7±1.5 3.8±1.1 6.2±2.1 4.1±0.8 4.1±0.7 4.0±1.2 RSP PD SB SP sham IR RPC RPD RSB RSP PD SB SP sham IR RPC RPD RSB RSP PD SB SP 297±49 361±67 397±80 377±73 239±70 196±28 252±46 246±46 275±65 212±37 233±42 214±20 246±61 14.0±1.7 14.8±3.8 17.1±3.2 15.2±5.3 13.4±2.4 14.2±4.4 17.5±2.7 16.8±4.1 16.8±4.6 272±45 314±97 255±17 317±55 211±63 173±40 181±63 213±46 174±47 168±25 192±17 201±18 200±46 11.2±2.3 9.9±1.6 13.1±4.7 8.7±2.5 7.1±2.5 12.1±5.3 13.2±1.8 9.6±2.9 11.2±5.5 159±58＃＃162±39＃＃163±55＃＃178±39＃＃186±58 59±15＃＃88±43＃＃106±32＃＃111±34＃＃92±37＃＃90±25＃＃89±34＃＃103±20＃＃8.5±2.6 5.4±2.0 6.2±2.5 3.9±2.1＃4.1±1.4 6.1±1.4 4.0±1.1＃4.9±1.5 3.9±1.4 197±74 186±67 182±42 203±77 247±40 168±28 91±18＃110±41 113±24 135±60 111±39 140±23 106±34 149±25 7.3±2.5 6.7±1.8 7.2±2.2 4.3±1.7 4.3±1.2 7.8±2.6 4.5±1.0 5.9±1.7 4.5±1.3

綜上所述，JNK和ERK信號通路在瑞芬太尼預(yù)處理減輕心力衰竭大鼠離體心臟的缺血／再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。

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