徐 婧，朱林卉，王德彬，胡 鑫，楊光忠

（中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430074）

糖尿病是一種遺傳和環(huán)境多因素影響的代謝性疾病，嚴重威脅人類健康。2型糖尿病占糖尿病的絕大多數(shù)，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病的主要發(fā)病因素［1］。齊墩果酸（oleanolic acid，OA）是一種具有保肝、抗炎、抗腫瘤等多種生理活性的五環(huán)三萜類化合物，以游離或結(jié)合成苷的形式在自然界廣泛存在［2－3］。研究表明，OA能有效降低血糖，增加血糖耐受，明顯提高肝糖原與血清胰島素水平，從而改善胰島素抵抗［4－5］。為了在 OA結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)更多高活性、低毒性的新藥物先導(dǎo)化合物，國內(nèi)外學者針對OA進行了結(jié)構(gòu)修飾，并得到了大量具有抗糖尿病活性的化合物［2，6］，本課題組以O(shè)A為骨架引入藥效團查耳酮，合成了化合物｛4-［（E）-3-（4-Bromo-phenyl）acryloyl］phenyl｝-indole［3，2－b］olean-12-en-28-oate（Bio，結(jié)構(gòu)式見Fig 1）［7］。為探索Bio改善胰島素抵抗的作用，本研究建立胰島素抵抗的HepG2細胞模型，檢測Bio對模型細胞胰島素抵抗的改善作用，并通過分析Bio對模型細胞中PPARγmRNA和蛋白表達的影響，探討其改善胰島素抵抗的作用機制。

Fig 1 Structure of compound Bio

1 材料與方法

1.1 細胞來源 HepG2人肝癌細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC武漢大學）。

1.2 主要試劑及儀器 齊墩果酸衍生物Bio，本課題組合成；葡萄糖檢測試劑盒，北京金豪制藥股份有限公司；二甲亞砜（DMSO），Biosharp公司；RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清（FBS）、RNA小量制備試劑盒，Axygen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa公司；牛胰島素、胰酶，Sigma公司；Rabbit Anti-PPARγ、Mouse Anti-β-actin、Anti-rabbit IgG、Anti-mouse IgG，武漢博士德生物工程有限公司；354型多功能酶標儀，美國Thermo公司；Universal HoodⅡ型凝膠成像儀，美國 Bio-rad公司；TP600型 PCR儀，日本TaKaRa公司。

1.3 HepG2細胞的培養(yǎng) 將HepG2細胞置于50 ml培養(yǎng)瓶中，用含體積分數(shù)為10% 滅活FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至單層貼壁，每3 d按1∶3的比例傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立 參考文獻方法［8］進行。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將處于對數(shù)期的HepG2細胞配制成細胞懸液，以1×108cells·L－1的濃度每孔100μl接種于96孔板。待細胞單層貼壁后，用PBS洗滌細胞兩次。每孔加100μl無血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓12 h后，對照組加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，模型組分別加入200μl新配制的含有胰島素濃度分別為1.72×10－5、10－6、10－7、10－8mol· L－1的 2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，加入無血清DMEM培養(yǎng)基200μl孵育24 h，使用葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)基中葡萄糖濃度。以未接種細胞的空白復(fù)孔糖含量相減，計算出各孔細胞的葡萄糖消耗量。選擇對照組與模型組細胞葡萄糖消耗量差值最大的胰島素作用濃度作為胰島素適宜濃度。

確定胰島素適宜濃度后，按照上述方法，胰島素作用24、36和48 h后，計算各組細胞的葡萄糖消耗量，檢測胰島素抵抗模型的持續(xù)穩(wěn)定時間。

1.5 細胞分組及處理 依據(jù)不同實驗要求，對細胞進行如下分組處理：①對照組（Control）：培養(yǎng)液中不含有胰島素；②模型組（Model）：培養(yǎng)液含1.72×10－5mol·L－1胰島素；③二甲雙胍組（DMBG）：模型組 ＋1×10－6mol·L－1的二甲雙胍；④Bio高濃度組（Bio H）：模型組 ＋1×10－5mol·L－1化合物 Bio；⑤Bio中濃度組（Bio M）：模型組 ＋1×10－6mol·L－1化合物Bio；⑥Bio低濃度組（Bio L）：模型組 ＋1×10－7mol·L－1化合物 Bio。

1.6 葡萄糖消耗及MTT實驗 對照組、模型組與化合物處理組細胞按照“1.5”所示處理后，于37℃，5%CO2條件下培育24 h，吸取細胞培養(yǎng)上清液2 μl，采用葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量。以未接種細胞的空白復(fù)孔糖含量相減，計算出各孔細胞的葡萄糖消耗量。

葡萄糖消耗檢測結(jié)束后，參考文獻［9］，使用MTT法測定細胞存活率，用于考慮細胞增殖對葡萄糖消耗的影響。

1.7 PPARγmRNA表達水平檢測 細胞造模成功后，按照“1.5”所示給予相應(yīng)藥物處理，然后將細胞轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管，按試劑盒說明提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定260 nm和280 nm波長下的A值，計算RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA質(zhì)量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，作為PCR反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，59℃退火1 min，72℃延伸30 s，35個循環(huán)后，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析成像，以目的CAP片斷／β-actin片斷的條帶光密度比值進行比較（GSR）。所用引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。PPARγ上游引物為5′-TCAAACACATCACCCCCCTG-3′；下 游 引 物 為 5′-ACCCCATCTTTATTCATCAA-3′；β-actin 上 游 引 物 為 5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′；下游引物 為 5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′。

1.8 PPARγ的蛋白表達檢測 藥物處理細胞后，將細胞移至1.5 ml離心管，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定所得各組蛋白濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h，加入PPARγ一抗（1∶200），4℃過夜。用含吐溫-20的TBST緩沖液洗膜3次，然后加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜后，ECL化學發(fā)光法檢測條帶。

1.9 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用Origin 6.5軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 胰島素抵抗模型的建立及鑒定 如Tab 1所示，模型細胞經(jīng) 1.72×10－5、10－6、10－7mol·L－1胰島素處理24 h后，葡萄糖消耗量均較對照細胞低，1.72×10－5mol·L－1胰島素處理的模型組與對照組細胞的葡萄糖消耗量差值最大，二者差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），由此可確定誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細胞模型的胰島素作用濃度為1.72×10－5mol·L－1。在該胰島素濃度下，24、36、48 h時間點模型細胞葡萄糖的消耗量均低于對照細胞（Tab 2，P＜0.05），胰島素抵抗持續(xù)存在，表明該模型可穩(wěn)定至48 h。

Tab 1 Effect of different concentrations of insulin onglucose consumption of HepG2（±s，n＝3）

Tab 1 Effect of different concentrations of insulin onglucose consumption of HepG2（±s，n＝3）

*P＜0.05 vs control

G r o u p C o n c e n t r a t i o n o f i n s u l i n／m o l·L－1 G l u c o s e c o n s u m p t i o n／m m o l·L－1 C o n t r o l 0 2.6 7±0.1 9 M o d e l 1.7 2×1 0－5 1.4 1±0.1 2*1.7 2×1 0－6 1.9 4±0.1 6*1.7 2×1 0－7 2.0 9±0.1 0*1.7 2×1 0－8 2.7 0±0.1 8

Tab 2 Effect of action time of insulin on glucose consumption of HepG2±s，n＝3）

Tab 2 Effect of action time of insulin on glucose consumption of HepG2±s，n＝3）

*P＜0.05 vs control

G r o u p G l u c o s e c o n s u m p t i o n／m m o l·L－1 2 4 h 3 6 h 4 8 h C o n t r o l 2.6 7±0.1 9 2.4 8±0.1 6 2.3 8±0.2 0 M o d e l 1.4 1±0.1 2* 1.0 8±0.1 0* 1.5 6±0.1 4*

2.2 Bio對胰島素抵抗Hep G2細胞模型葡萄糖消耗量的影響 藥物作用模型細胞24 h后，測定培養(yǎng)液中葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量，如Tab 3所示。結(jié)果顯示，與模型細胞相比，10－5、10－6、10－7mol· L－13個濃度的Bio處理均可增加HepG2細胞模型葡萄糖消耗量（P＜0.05），增加率分別為135%、62%、39%，10－5、10－6化合物對葡萄糖消耗量的增加率高于同等濃度的陽性對照藥二甲雙胍（P＜0.05）。同時可以看到，Bio促進葡萄糖消耗的作用呈劑量依賴性增加。

2.3 Bio對胰島素抵抗的 HepG2細胞 PPARγ mRNA表達的影響 利用 RT-PCR檢測 PPARγ mRNA的表達量，并對電泳結(jié)果進行灰度分析，結(jié)果如Fig 2所示。與對照組相比，胰島素抵抗模型的PPARγ表達量降低（0.89±0.06，P＜0.05）。與模型組相比，陽性對照二甲雙胍可以提高PPARγ的表達量（1.67±0.07，P＜0.05）；不同濃度的 Bio處理均可以提高模型細胞中PPARγmRNA的表達量，但刺激作用低于二甲雙胍，分別為Bio H組（1.07±0.07，P＜0.05）、Bio M組（1.04±0.08，P＜0.05）、Bio L組（0.93±0.05，P＜0.05）。

Fig 2 Expression of PPARγmRNA in different groups1：Control；2：Model；3：DMBG；4：Group Bio H；5：Group Bio M；6：Group Bio L.＃P＜0.05 vs control；*P＜0.05 vs model.

Tab 3 Effect of Bio on glucose consumption of IR Hep G2±s，n＝3）

Tab 3 Effect of Bio on glucose consumption of IR Hep G2±s，n＝3）

*P＜0.05 vs model；＃P＜0.05 vs DMBG

G r o u p D o s e／m o l· L－1 G l u c o s e c o n s u m p t i o n／M T T／m m o l·L－1 C o n t r o l － 2.8 8±0.6 M o d e l － 1.9 6±0.7 B i o 1 0－5 4.6 1±0.6*＃1 0－6 3.1 7±0.1*＃1 0－7 2.7 2±1.6*D M B G 1 0－5 3.2 5±0.8 1 0－6 3.0 5±1.0 1 0－7 3.0 0±0.1

2.4 Bio對胰島素抵抗的Hep G2細胞PPARγ蛋白表達的影響 使用不同濃度藥物處理模型組細胞，Western blot測定細胞中 PPARγ的蛋白表達。結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組細胞的PPARγ的蛋白表達量明顯降低（0.27±0.08，P＜0.05）；二甲雙胍和不同濃度的Bio處理均可以上調(diào)模型細胞中PPARγ蛋白的表達，與模型組相比差異具有顯著性（P＜0.05），分別為 DMBG組（1.35±0.07，P＜0.05）、Bio H組（1.81±0.07，P＜0.05）、Bio M組（0.45±0.04，P＜0.05）、Bio L組（0.31±0.05，P＜0.05）。Bio H組對PPARγ上調(diào)作用高于二甲雙胍。見Fig 3。

Fig 3 Expression of PPARγprotein in different groups1：Control；2：Model；3：DMBG；4：Group Bio H；5：Group Bio M；6：Group Bio L.＃P＜0.05 vs control；*P＜0.05 vs model

3 討論

目前針對2型糖尿病的治療手段常采用化學合成的降糖藥物，但存在多種不良反應(yīng)，如乳酸中毒、低血糖、肝腎損傷等［10］，以天然化合物為先導(dǎo)物，通過結(jié)構(gòu)修飾發(fā)現(xiàn)新的高效低毒的藥物先導(dǎo)化合物是抗糖尿病新藥研究和開發(fā)的重要途徑之一［11］。齊墩果酸作為從植物提取的一類具有廣泛藥理作用的天然產(chǎn)物，在針對糖尿病的研究中表現(xiàn)出很好的研究價值［5］，本課題組前期通過對齊墩果酸的結(jié)構(gòu)修飾得到了一系列具有較高體外降糖活性的化合物［12］。

胰島素抵抗是2型糖尿病的重要發(fā)病機制之一，貫穿著2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展全過程，是導(dǎo)致糖尿病各種并發(fā)癥的“動力”根源［1］。肝臟是胰島素作用的主要靶器官，參與空腹狀態(tài)下的內(nèi)生性糖的產(chǎn)生和輸出，以及進食后糖的吸收、利用和儲存，胰島素抵抗在肝臟的后果主要表現(xiàn)為肝臟攝取葡萄糖和合成糖原的能力下降，導(dǎo)致餐后血糖升高［13］。通過高濃度胰島素誘導(dǎo)肝臟細胞產(chǎn)生胰島素抵抗，便于觀察干預(yù)因素對胰島素抵抗的直接影響，并可在細胞水平探討胰島素抵抗形成的機制。本研究中經(jīng)高濃度胰島素誘導(dǎo)的HepG2細胞，葡萄糖攝取能力明顯低于未誘導(dǎo)細胞，細胞的胰島素敏感性降低，胰島素抵抗細胞建立成功。在此基礎(chǔ)上探討B(tài)io對葡萄糖消耗的影響，研究結(jié)果顯示，在胰島素抵抗狀態(tài)下，高、中、低濃度的Bio均可以促進HepG2細胞的葡萄糖消耗量，并且高、中濃度的Bio促進效果優(yōu)于同等濃度的二甲雙胍，表明Bio可以增強胰島素敏感性，改善胰島素抵抗。

過氧化物酶體增殖物激活受體 （PPARs）是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核激素受體超家族，具有α、β、γ3種亞型，在調(diào)節(jié)脂肪合成、能量穩(wěn)定、糖脂代謝平衡中起著重要作用［14］。其中，PPARγ能夠增加外周組織對胰島素的敏感性，其機制可能是通過抑制脂肪分化相關(guān)因子的分泌，減少胰島素抵抗因子的產(chǎn)生；抑制胰島素受體底物磷酸化，導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運體（GLUT）轉(zhuǎn)位增加，促進脂肪組織和骨骼肌的葡萄糖攝取，從而改善胰島素抵抗。如抗糖尿病藥物噻唑烷二酮類（TZDs）作為PPARγ的外源性配體，能夠有效激活PPARγ，調(diào)控磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK）、GLUT4和胰島素受體等基因的轉(zhuǎn)錄，促進葡萄糖轉(zhuǎn)運，增加胰島素敏感性［15］。本研究通過RT-PCR和Western blot的結(jié)果均表明，Bio能夠明顯促進胰島素抵抗細胞的PPARγ的表達，改善胰島素抵抗狀態(tài)下的糖脂代謝紊亂，且在蛋白水平，10－5mol·L－1的化合物對PPARγ的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于二甲雙胍，說明Bio通過PPARγ改善胰島素抵抗，是一種潛在的PPARγ激動劑。

Corbin等報道Escherichia coli蛋白的豐度變化與轉(zhuǎn)錄水平的變化有非常高的相關(guān)性，而Gygi等及Xia等在實驗中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達水平與轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性較低。本研究中，Bio M和Bio L組處理后，PPARγ在mRNA和蛋白水平的變化情況一致：與模型組細胞相比表達水平上調(diào)，且上調(diào)作用均低于陽性對照二甲雙胍。但是，Bio H組處理后，PPARγ mRNA水平的表達量低于二甲雙胍，蛋白水平表達量卻高于二甲雙胍組，造成mRNA和蛋白水平不一致性的原因可能如下：①轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的存在：mRNA在翻譯成蛋白質(zhì)的過程中，涉及到轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯后修飾等過程；② mRNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的差異；③實驗技術(shù)本身原因：RT-PCR和Western blot均為半定量分析、不同的操作者人為引入的誤差等。雖然Bio H組處理后，PPARγ在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達出現(xiàn)了不一致，但與模型組細胞相比，PPARγ的表達均上調(diào)。

綜上所述，齊墩果酸衍生物 Bio能夠改善HepG2細胞的胰島素抵抗狀態(tài)，其機制與增強轉(zhuǎn)錄因子PPARγmRNA和蛋白表達，提高胰島素敏感性相關(guān)。但其作用于PPARγ后，下游相關(guān)基因的表達變化以及信號通路有待于進一步研究。

參考文獻：

［1］ Ravi K，Ramachandran B，Subramanian S.Protective effect of eugenia jambolana seed kernel on tissue antioxidants in streptozotocin induced diabetic rats［J］.Biol Pharm Bull，2004，27（8）：1212－7.

［2］ Fred-Jaiyesimi A，Kio A，Richard W.α-Amylase inhibitory effect of 3β-olean-12-en-3-yl（9Z）-hexadec-9-enoate isolated from Spondias mombin leaf［J］.Food Chem，2009，116（1）：285－8.

［3］ Hung H Y，Qian K，Morris-Natschke SL，et al.Recent discovery of plant-derived anti-diabetic natural products［J］.Nat Prod Rep，2012，29（5）：580－606.

［4］ Chen J，Liu J，Zhang L，et al.Pentacyclic triterpenes.part 3：synthesis and biological evaluation of oleanolic acid derivatives as novel inhibitors of glycogen phosphorylase［J］.Bioorg Med Chem Lett，2006，16（11）：2915－9.

［5］ de Melo CL，Queiroz M G，F(xiàn)onseca SG，et al.Oleanolic acid，a natural triterpenoid improves blood glucose tolerance in normal mice and ameliorates visceral obesity in mice fed a high-fat diet［J］.Chem Biol Interact，2010，185（1）：59－65.

［6］ 唐 初，陳 玉，柏 舜，等.齊墩果酸的結(jié)構(gòu)修飾與生物活性研究進展［J］.有機化學，2013，33（1）：46－65.

［6］ Tang C，Chen Y，Bai S，et al.Advances in the study of structural modification and biological activities of oleanolic acid［J］.Chin J Org Chem，2013，33（1）：46－65.

［7］ Tang C，Zhu L H，Li J，et al.Synthesis and structure elucidation of five new conjugates of oleanolic acid derivatives and chalcones using 1D and 2D NMR spectroscopy［J］.Magn Reson Chem，2012，50（3），236－41.

［8］ 張汝學，賈正平，李茂星，等.體外胰島素抵抗細胞模型的建立及在藥物篩選中的應(yīng)用［J］.中國藥理學通報，2008，24（7）：971－6.

［8］ Zhang R X，Jia Z P，Li M X，et al.The establishment of insulin resistant model in vitro and preliminary application for screening drugs［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24（7）：971－6.

［9］ Zheng X K，Zhang L，Wang W W，et al.Anti-diabetic activity and potential mechanism of total flavonoids of Selaginella tamariscina（Beauv.）Spring in ratsinduced by high fat diet and low dose STZ［J］.J Ethnopharmacol，2011，137（1）：662－8.

［10］Ravi K，Ramachandran B，Subramanian S，et al.Protective effect of eugenia jambolana seed kernel on tissue antioxidants in streptozotocin induced diabetic rats［J］.Biol Pharm Bull，2004，27（8）：1212－7.

［11］余伯陽.以生物組合化學技術(shù)發(fā)現(xiàn)新高效低毒天然藥物先導(dǎo)化合物［J］.中國天然藥物，2007，5（3）：169－73.

［11］Yu B Y.Studies on the Bio-combinatorial chemistry as the new method for finding higher bioactive or lower toxicity leading compound［J］.Chin J Nat Med，2007，5（3）：169－73.

［12］Tang C，Zhu L H，Chen Y，et al.Synthesis and biological evaluation of oleanolic acid derivative-chalcone conjugates asα-glucosidase inhibitors［J］.RSC Adv，2014，4（21）：10862－74.

［13］李婷婷，高麗昌，唐 祿，等.成纖維細胞生長因子-21改善胰島素抵抗肝細胞對葡萄糖的吸收及機制［J］.中國藥理學通報，2012，28（3）：366－71.

［13］Li T T，Gao L C，Tang L，et al.The effect of FGF-21 on the glucose uptakes and insulin resistance in cultured human liver cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（3）：366－71.

［14］丁世英，申竹芳，謝明智.PPAR與胰島素抵抗［J］.中國藥理學通報，2002，18（3）：241－5.

［14］Ding SY，Shen Z F，Xie M Z.PPAR and insulin resistance［J］.Chin Pharmacol Bull，2002，18（3）：241－5.

［15］Pauli JR，Ropelle E R，Cintra D E，et al.Acute physical exercise reverses S-nitrosation of the insulin receptor，insulin receptor substrate 1 and protein kinase B／Akt in diet-induced obese Wistar rats［J］.J Physiol，2008，586（2）：659－71.