丁 慧，陳 虹，姜 勇，屠鵬飛，馬婧怡，張萬鑫

（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，教育部新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002；2.北京大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，北京 100191）

阿爾采末病 （Alzheimer’s disease，AD）是一種不可逆轉(zhuǎn)的、進(jìn)行性的慢性神經(jīng)退行性疾病，由多種原因引發(fā)，其中與海馬和皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元異常密切相關(guān)。研究表明，AD病變物質(zhì)基礎(chǔ)與人體某些對學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能有特殊作用的神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿、單胺類、氨基酸類及神經(jīng)肽類等物質(zhì)的改變或失衡密切相關(guān)［1－2］。記憶是由無數(shù)神經(jīng)細(xì)胞間突觸直接改變所產(chǎn)生的效應(yīng)，神經(jīng)遞質(zhì)通過第二信使引起蛋白磷酸化，啟動(dòng)新蛋白質(zhì)合成，使其進(jìn)入細(xì)胞核后，使得生物產(chǎn)生了短期和長期記憶。

松果菊苷 （echinacoside，ECH）是從新疆特色植物、國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材肉蓯蓉中分離、純化的苯乙醇苷類化合物的主要成分［3］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，ECH有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用腦微透析技術(shù)與高效液相色譜聯(lián)用電化學(xué)檢測（HPLC-ECD）法，動(dòng)態(tài)檢測ECH對AD大鼠海馬、皮質(zhì)細(xì)胞外液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響，初步探討ECH改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 ECH由北京大學(xué)屠鵬飛教授惠贈(zèng)（純度95%以上）；石杉堿甲片（河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號：120708）；去甲腎上腺素（NE）、多巴胺 （DA）、5-羥色胺 （5-HT）、庚烷磺酸鈉均購自美國Sigma公司；甲醇（Fisher公司，色譜純）；檸檬酸磷酸鋅水門?。ㄉ虾ａt(yī)療器械股份有限公司產(chǎn)品，由液體和粉劑組成，用時(shí)調(diào)和）；檸檬酸（上海山浦化工有限公司）；檸檬酸鈉 （天津市博迪化工有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉 （天津市北方化玻購銷中心）；腦微透析灌流液為復(fù)方氯化鈉注射液（北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；所用水均為Millipore超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，♂，體質(zhì)量290～320 g，購自新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證編號：SCXK（新）：2011－0002，飼養(yǎng)條件為室溫20℃～23℃，濕度為50%～70%，自由進(jìn)水、攝食，自然光照。

1.3 主要儀器 腦微透析儀器包括：美國 BAS 4100型大鼠腦立體定位儀，CMA／12探針（分子截留量15 ku，膜長4 mm，瑞典 Microbiotech公司）及探針套管，CMA／402型微量注射泵，CMA／150低溫樣品自動(dòng)收集器，CMA／120清醒動(dòng)物自由活動(dòng)裝置；高效液相色譜系統(tǒng)（HPLC）包括：島津 LC-20AB輸液泵，島津 CTO-10ASvp柱溫箱，ANTEC DECAE-D2SDC電化學(xué)檢測器，玻璃碳工作電極和Ag／AgCl參考電極，Hypersil-GOLD ODS C18色譜柱 （美國 Waters公司，250 mm×4.6 mm，5μm）；其他：DMS-2型Morris水迷宮，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；Varioskan Flash 4.00.51酶標(biāo)儀，美國Thermo electron公司。

2 方法

2.1 模型建立［4］造模組大鼠采用腹腔注射D-半乳糖0.1 mg·g－1，每天1次，共計(jì)56 d，于 d 43用5μl微量注射器開孔處進(jìn)入大鼠右側(cè)海馬背部，緩慢勻速注射 5μl凝聚態(tài) Aβ25－35，注射速度 1μl·min－1，注射時(shí)間 5 min，并留針 5 min，聯(lián)合建立動(dòng)物AD模型。

2.2 分組及給藥方法 將大鼠隨機(jī)分為6組：模型組、ECH低劑量組 （10μg·g－1）、ECH中劑量組（20μg·g－1）、ECH高劑量組 （40μg·g－1）、陽性藥石杉堿甲組 （Hup-A，0.02μg·g－1）、假手術(shù)組（生理鹽水1μl·g－1）。各組大鼠每天腹腔注射相應(yīng)的藥物和生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。

2.3 Morris水迷宮檢測 Morris水迷宮是用于評價(jià)大鼠對空間學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力，由圓形水池、自動(dòng)錄像及分析系統(tǒng)共同組成。實(shí)驗(yàn)時(shí)，在水池中注入清水，水溫保持在 （24±2）℃，水面高于平臺約2 cm。在水池上方安置有與計(jì)算機(jī)相連接的攝像監(jiān)視系統(tǒng)，調(diào)試攝像頭，使電腦屏幕中清晰顯示水迷宮分為4個(gè)象限，并同步準(zhǔn)確記錄大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。訓(xùn)練期間，水迷宮外參照物保持不變，同時(shí)盡量減少聲響及燈光的影響，盡可能在較暗的環(huán)境中進(jìn)行。

2.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn)［5］將大鼠面向池壁依次從4個(gè)象限的中點(diǎn)位置放入水池，當(dāng)大鼠已爬上平臺或設(shè)定的訓(xùn)練時(shí)間（120 s）已到，計(jì)算機(jī)便停止跟蹤，并記錄游泳軌跡。在超過訓(xùn)練時(shí)間 （120 s）仍未找到平臺的大鼠，將引導(dǎo)其到達(dá)平臺，休息30 s，幫助其學(xué)習(xí)記憶平臺位置。

2.3.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)5 d后，d 6將平臺移除，任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入水池中，在規(guī)定的120 s內(nèi)，統(tǒng)計(jì)大鼠穿越原平臺位置的次數(shù)及停留原平臺象限時(shí)間，用于測定大鼠對平臺空間位置記憶的保持能力。

2.4 透析套管的植入及微透析液的收集 將各組大鼠在給藥結(jié)束前3 d，用10% 水合氯醛 （3.5μl·g－1）麻醉，固定于 BAS 4100腦立體定位儀，參照Paxinos G《大鼠腦立體定位圖譜》［6］將探針導(dǎo)管固定于腦立體定位儀，以前鹵為基點(diǎn)，分別依次植入大鼠海馬 （坐標(biāo) AP：＋3.5 mm；ML：＋2.0 mm；DV：－3.0 mm）和皮質(zhì)（坐標(biāo) AP：＋3.0 mm；ML：－1.6 mm；DV：－3.5 mm），并在套管附近另固定1枚小螺釘呈三角形分布，之后用檸檬酸磷酸鋅水門汀液體和粉劑調(diào)和后固定，術(shù)后腹腔注射硫酸慶大霉素預(yù)防感染。套管植入后，待大鼠清醒后，在自由活動(dòng)狀態(tài)下立即將套管芯小心拔出，并將微透析探針小心地插入預(yù)留在海馬、皮質(zhì)的套管中，用復(fù)方氯化鈉注射液以2μl·min－1的速度灌流，另一端接入微透析灌流系統(tǒng)，4℃下每20 min收集1管腦微透析液。腦微透析結(jié)束后，將收集到的透析液凍存于－70℃冰箱，擇日測定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。統(tǒng)計(jì)方法為比較模型組與假手術(shù)組采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組數(shù)值間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 ECH對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 （水迷宮檢測） Morris水迷宮結(jié)果顯示，d 1、2，各組大鼠學(xué)習(xí)記憶水平比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），從d 3開始，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯長于正常對照組 （P＜0.05）；與模型組大鼠相比，ECH低、中、高劑量組、石杉堿甲組的逃避潛伏期差異具有顯著性（P＜0.01，P＜0.05）；ECH低、中、高劑量組與石杉堿甲組的大鼠之間的逃避潛伏期無明顯差異（P＞0.05）。在空間探索試驗(yàn)中，模型組大鼠在原平臺象限內(nèi)搜索時(shí)間和穿越平臺次數(shù)明顯少于正常組；ECH低、中、高劑量組與陽性藥對照組大鼠在原平臺象限內(nèi)搜索時(shí)間和穿越平臺次數(shù)明顯多于模型組（P＜0.05），而少于正常對照組（P＜0.05），見 Fig 1。

3.2 HPLC-ECD分析［7］流動(dòng)相每升含 0.15 mol·L－1檸檬酸 －檸檬酸鈉緩沖液 829 ml、0.1 mol·L－1EDTA·2Na 1 ml、1.416 g庚烷磺酸鈉、甲醇150 ml，混合過膜。流動(dòng)相流速為1 ml·min－1。柱溫箱溫度28℃。電化學(xué)檢測器工作電壓為700 mV，增益2 nA。分別取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、腦微透析液進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20μl，色譜圖結(jié)果見Fig 2。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 量取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加高氯酸制備成標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線用0.5、1、2、4、16 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積 （Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸分析，回歸方程為：NE：＾Y＝35748X＋54425（r2＝0.9997）；DA：＾Y＝109204X＋39243（r2＝0.9997）；5-HT：＾Y＝262300X－145774（r2＝0.9997）。3種標(biāo)準(zhǔn)品在0.5～16 mg·L－1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

Fig 1 Performance of the rats in the Morris water maze±s，n＝10）Effect of ECH on the performance of the Morris water maze test.A：The escape latency time in 5 days in the hidden platform test；B：The number of platform crosses in the probe trail；C：The Morris water maze assay with the platform removed to evaluate the time of animals spent in the target quadrant.＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Fig 2 Monoamine neurotransmitter of brain microdialysis HPLC-ECD chromatographyA：Blank solvent HPLC chromatogram；B：Standard HPLC-ECD chromatography；C：Monoamine neurotransmitter of brain microdialysis HPLC-ECD chromatography

3.4 ECH對AD模型大鼠海馬、皮質(zhì)中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠皮質(zhì)、海馬中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平均明顯下降 （P＜0.01），模型組大鼠皮質(zhì) （cerebral cortex，CC）中NE、DA、5-HT含量分別下降74.5%、46%、61.4%；海馬 （hippocampus，HC）中這3種單胺類物質(zhì)分別下降90.20%、76.9%、56%。給予ECH后，ECH各組CC、HC中NE、DA、5-HT的含量相比模型組，發(fā)生不同幅度的上升，ECH高劑量組（40 mg·kg－1）升高最為明顯 （P＜0.05或 P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ECH具有提高AD模型大鼠皮質(zhì)、海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的作用，見Tab 1。

4 討論

本研究采用腦內(nèi)微透析技術(shù)同時(shí)檢測大鼠海馬和大腦皮質(zhì)內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AD模型組大鼠海馬和皮質(zhì)內(nèi)DA、NE、5-HT含量均明顯低于假手術(shù)組，提示采用D-半乳糖合并海馬內(nèi)注射Aβ25－35可致腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平降低。通過Morris水迷宮驗(yàn)證學(xué)習(xí)記憶能力，高效液相色譜－電化學(xué)檢測法測定不同大腦組織細(xì)胞外液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，從這兩個(gè)方面對大鼠學(xué)習(xí)記憶力進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性評價(jià)。結(jié)果表明，該模型方法具有科學(xué)性、合理性，同時(shí)符合臨床AD的病理學(xué)特點(diǎn)，為研發(fā)藥物抗AD提供了較理想的動(dòng)物模型。

Tab 1 Change of levels of NE，DA，5-HT in different brain regions of different groups（xˉ±s，n＝10）

Tab 1 Change of levels of NE，DA，5-HT in different brain regions of different groups（xˉ±s，n＝10）

＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Group Dose／μg·g－1 Norepinephrine level／mg·L－1Dopamine level／mg·L－1Serotonin level／mg·L－1 CC HC Sham － 20.23±1.24 39.6±1.45 67.10±1.29 40.18 CC HC CC HC±1.34 8.05±0.34 8.91±0.32 Model － 5.16±0.44＃＃ 3.88±1.33＃＃ 36.23±2.48＃＃ 9.28±0.51＃＃ 3.11±0.51＃＃ 3.92±0.11＃＃ECH-L 10 8.62±0.15** 5.00±1.36 47.10±1.87**11.96±0.72** 4.04±0.20** 5.06±0.13**ECH-M 20 12.59±0.52** 9.82±1.02 54.71±1.53**13.55±0.63** 4.79±0.49** 5.88±0.25**ECH-H 40 15.36±0.28**12.98±1.24* 65.03±2.16**16.89±0.67** 5.69±0.16** 7.18±0.21**Hup-A 0.02 16.63±0.35**13.18±1.71* 66.66±1.90**17.17±0.37** 6.78±0.27** 7.33±0.77**

AD是一種不可逆的、漸進(jìn)性的腦功能紊亂性疾病，除了斑塊形成和神經(jīng)元纖維纏結(jié)，另一個(gè)標(biāo)志是損害神經(jīng)元合成NE［8］，從而逐漸導(dǎo)致記憶喪失、行為異常、人格改變及思維能力下降，AD所致的記憶力嚴(yán)重下降主要是由于神經(jīng)元傳遞受損。Ganguly等［9］研究表明，在一些更高級的腦組織，如海馬體，NE通過激活β腎上腺素受體，在注意力和記憶的認(rèn)知過程中發(fā)揮增強(qiáng)作用。NE從腦內(nèi)藍(lán)斑核中釋放，且負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)各種功能，抑郁、癡呆、警覺性和注意力下降都與NE不足有關(guān)。AD模型組大鼠皮質(zhì)、海馬細(xì)胞外液中的NE活性下降，活性的改變與AD的嚴(yán)重程度有關(guān)，連續(xù)4周給予ECH干預(yù)后，AD模型大鼠海馬、皮質(zhì)中NE水平明顯升高，其可能是通過刺激不同大腦區(qū)域的腎上腺素能受體發(fā)揮作用。另外，ECH可以升高下降的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，從而抑制腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量減少導(dǎo)致的神經(jīng)元缺失，進(jìn)而減少對記憶力的損害，但其作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。我們的研究結(jié)果與Hammerschmidt等［10］文獻(xiàn)報(bào)道一致，在NA缺乏過程中通過改變Ca2＋／鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶或鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ以及NMDA受體水平從而導(dǎo)致認(rèn)知障。

DA經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)是影響記憶能力，調(diào)節(jié)精神活動(dòng)、情緒、思維和推理過程的關(guān)鍵性神經(jīng)遞質(zhì)［11］，其中，大腦前額葉皮層 （PFC）神經(jīng)環(huán)路，尤其是谷氨酸能神經(jīng)元與多巴胺能神經(jīng)元之間的平衡，決定工作記憶的功能，因此，DA參與多重環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)與記憶功能。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠海馬、皮質(zhì)的細(xì)胞外液中的DA含量與假手術(shù)組相比明顯下降，DA的減少可能是由于NE能的利用率降低，NE神經(jīng)元和DA神經(jīng)元同時(shí)作用于海馬、前額葉皮層等腦區(qū)，這些腦結(jié)構(gòu)參與大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。同時(shí)，DA可產(chǎn)生羥氧自由基，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)元損傷，而神經(jīng)退性行疾病，其中包括AD，其主要發(fā)病機(jī)制之一是氧化應(yīng)激反應(yīng)。我們的研究結(jié)果支持了先前Zhong等［12］報(bào)道ECH的化學(xué)結(jié)構(gòu)有利于降低·OH水平，減輕腦損傷程度，從而產(chǎn)生腦神經(jīng)的保護(hù)作用。

越來越多的證據(jù)已經(jīng)表明，5-HT參與許多生理或病理過程，包括認(rèn)知功能［13］。中縫核既是5-HT能神經(jīng)元密集區(qū)，也是AD中神經(jīng)纖維纏結(jié)與神經(jīng)元丟失最早區(qū)域之一，因此，認(rèn)為可能與AD之間存在某種聯(lián)系，但在這個(gè)問題上的研究結(jié)果一直存在不一致［14］。5-HT水平的下降影響著腦5-HT受體功能紊亂，與此同時(shí)，單胺氧化酶 （MAO）是腦內(nèi)單胺類的一種重要的代謝酶，衰老及AD腦組織中MAO-B活性升高，可加速氧化分解NE、DA、5-HT等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，由此可以解釋AD模型大鼠海馬區(qū)萎縮與記憶障礙現(xiàn)象出現(xiàn)的相關(guān)性。文獻(xiàn)已證實(shí)［12－15］，ECH具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用和延緩衰老作用，并且能夠抑制腦內(nèi)MAO的活性，從而改善記憶功能。

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