李 覃，董小青，王翼騰，劉曉光，王 偉，周 欣2，，陳 虹，5

（1.武警后勤學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室，天津 300309；2.天津市心血管重塑與靶器官損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162；3.武警后勤學(xué)院生藥與藥劑學(xué)教研室，天津 300309；4.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院，天津 300162；5.天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300309）

免疫調(diào)節(jié)劑多用于治療免疫系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致的相關(guān)疾病。目前，臨床上常用的西藥類(lèi)免疫調(diào)節(jié)劑包括糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞增殖抑制劑、免疫抑制劑等，但是，這些藥物大多存在毒副作用和療效局限等問(wèn)題。在此背景下，人們開(kāi)始把目光投向中藥。中藥是我國(guó)自然科學(xué)中最有特色的研究領(lǐng)域，能夠整合調(diào)節(jié)機(jī)體各項(xiàng)功能，作用途徑廣泛，使毒副作用降到最低。萜類(lèi)化合物是廣泛分布于多種植物的天然產(chǎn)物，其中二萜類(lèi)化合物以其結(jié)構(gòu)多樣、生物活性強(qiáng)而備受關(guān)注。

金錢(qián)松是現(xiàn)今僅存于中國(guó)的單屬單種特有植物。土槿皮（也叫土荊皮）是金錢(qián)松的近根樹(shù)皮，屬《中華人民共和國(guó)藥典》收載的常用中藥，其中最主要的活性成分即為二萜類(lèi)化合物土槿乙酸（pseudolaric acid B，PB）。PB具有獨(dú)特的二萜母核以及內(nèi)酯環(huán)和共軛雙烯酸側(cè)鏈（Fig 1）［1］。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，PB能夠發(fā)揮抗真菌、抗血管生成、抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)［2］。我們前期發(fā)現(xiàn)［3－5］，PB可有效抑制抗原特異性免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生，但具體機(jī)制尚未完全闡明。本研究進(jìn)一步分析PB發(fā)揮作用的分子機(jī)制，為新型抗炎免疫調(diào)節(jié)藥物的研制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Fig 1 Structure of PB（C23 H28O8，MW：432.46）

1 材料與方法

1.1 主要材料 PB由本室提取自土槿皮（經(jīng)中國(guó)藥品生物制品檢定所檢測(cè)純度＞98%）。二硝基氟苯（DNFB）購(gòu)于 Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FCS）購(gòu)于Gibco公司；蘇木精、伊紅染色液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；PPARγ單克隆抗體購(gòu)于SAB公司；Akt及其磷酸化抗體phospho-Akt（Ser473）購(gòu)于Bioworld公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購(gòu)于Pierce公司；X-tremeGeneTMHP轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司。

清潔級(jí)BALB／c小鼠（6～8周，♀ 8～20 g）購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證SCXK－（軍）2012－004，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 小鼠CHS模型建立 80只BALB／c小鼠隨機(jī)分為8組（10只／組）：正常組、模型組、各劑量PB給藥組。參照Wang等［6］方法并略作調(diào)整建立接觸性超敏反應(yīng)（contact hypersensitivity，CHS）小鼠模型。實(shí)驗(yàn)前1日（day－1）小鼠腹部去毛約3 cm，開(kāi)始日（day 0）和第1日（day 1）于去毛部位涂0.5%DNFB（以4∶1丙酮橄欖油配制）40μl致敏。6日后于鼠耳內(nèi)外側(cè)涂0.2%DNFB 20μl激發(fā)。

1.3 給藥方法 PB混懸于生理鹽水，連續(xù)口服給藥10 d（day-1至day 8），正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服等量生理鹽水（vehicle）。同時(shí)，另取正常小鼠給予相同劑量PB，觀察PB對(duì)正常機(jī)體是否有毒副反應(yīng)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定 激發(fā)后48 h頸椎脫臼處死小鼠，用打孔器在相同部位取直徑8 mm耳片，游標(biāo)卡尺測(cè)厚度，電子天平稱(chēng)重量，以左右耳片厚度、重量之差為腫脹度。同時(shí)，稱(chēng)重各組小鼠脾臟，計(jì)算脾指數(shù)。

1.5 蘇木精－伊紅（HE）染色 取各組小鼠耳組織標(biāo)本，置中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片（3 μm），蘇木素 －伊紅染色，80%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師獨(dú)立通過(guò)顯微鏡觀察各組小鼠耳組織皮膚中的病理變化。

1.6 Western blot 收集各組小鼠脾臟，按說(shuō)明書(shū)操作提取組織蛋白，Bradford法定量蛋白含量，SDSPAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗（PPARγ、phospho-Akt）孵育，4℃過(guò)夜，TBST洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h，ECL法檢測(cè)。Stripping Solution洗脫、封閉后，再次加入抗-Akt抗體、二抗，同上述操作。最后進(jìn)行圖片掃描和分析，采用BioRad系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與報(bào)告基因檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人胚腎HEK-293細(xì)胞，1×105／孔接種于24孔板，24 h后待細(xì)胞融合70%～80%，換無(wú)抗完全DMEM培養(yǎng)基，1 h后轉(zhuǎn)染0.5μg TK-PPRE3-luc質(zhì)粒（由美國(guó)薩克生物研究學(xué)院R.M.Evans教授惠贈(zèng)）及0.02 μg質(zhì)粒pRL-TK（Promega產(chǎn)品）。根據(jù)說(shuō)明書(shū)用X-tremeGeneTMHP轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，不同濃度PB進(jìn)行體外干預(yù)，同時(shí)，以1μmol·L－1吡格列酮作為陽(yáng)性對(duì)照組，24 h后根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 PB的藥效學(xué)分析

2.1.1 PB抑制CHS小鼠耳腫脹 如Fig 2所示，PB能夠劑量依賴(lài)地抑制模型小鼠耳腫脹，20 mg·kg－1時(shí)抗炎效果達(dá)到平臺(tái)期，40 mg·kg－1時(shí)藥效有下降趨勢(shì)。低于20 mg·kg－1的情況下，正常給藥小鼠未見(jiàn)不良反應(yīng)，超過(guò)25 mg·kg－1后小鼠可見(jiàn)毛色暗淡、消瘦、腹瀉等不良反應(yīng)。因此，接下來(lái)選擇5、10、20 mg·kg－1分別作為低、中、高劑量組進(jìn)一步分析PB對(duì)CHS的其它藥效情況。

Fig 2 Oral treatment with PB suppressed CHS responsePB：pseudolaric acid B；Veh：CHS mouse model treated with saline；NOR：normal control.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vehicle

2.1.2 PB對(duì)脾指數(shù)的影響 如Fig 3所示，CHS模型組小鼠脾指數(shù)明顯升高，低、中、高劑量PB干預(yù)后均明顯降低升高的脾指數(shù)，差異具有顯著性（P＜0.05）。

2.1.3 耳組織形態(tài)學(xué) HE染色結(jié)果顯示（Fig 4），正常組小鼠耳組織厚度正常，幾乎無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠耳片表皮明顯增厚，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間水腫明顯，棘層和基底層有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，同時(shí)可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞等其它炎癥細(xì)胞。PB干預(yù)后能夠降低CHS小鼠耳組織腫脹，表皮及真皮水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，真皮血管擴(kuò)張充血現(xiàn)象緩解。

鑒于5 mg·kg－1的PB就能產(chǎn)生明顯抑制CHS小鼠炎癥發(fā)生、發(fā)展的藥效，顯示出良好的抗炎作用，因此，參考藥理學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［5］，后續(xù)研究即以該低劑量PB進(jìn)行機(jī)制探討。

2.2 PB免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制探討

2.2.1 PB促進(jìn)PPARγ表達(dá) 本部分研究首先通過(guò)Western blot檢測(cè)了PB干預(yù)前后CHS小鼠脾臟PPARγ的蛋白表達(dá)水平。如Fig 5所示，PB能夠明顯促進(jìn)PPARγ表達(dá)，與CHS組相比，差異具有顯著性（P＜0.01）。

2.2.2 PB上調(diào)PPARγ轉(zhuǎn)錄激活 為了進(jìn)一步確定PB對(duì)PPARγ轉(zhuǎn)錄激活的影響，我們應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因分析了PB對(duì)報(bào)告基因TK-PPRE3-luc的作用。PPARγ活化后可與報(bào)告質(zhì)粒啟動(dòng)子的PPRE結(jié)合，啟動(dòng)熒光素酶轉(zhuǎn)錄。雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示（Fig 6），PB能劑量依賴(lài)地促進(jìn)PPARγ轉(zhuǎn)錄激活，PPARγ陽(yáng)性對(duì)照藥物吡格列酮1μmol·L－1時(shí)的熒光素酶相對(duì)活性約36.2，活性高于PB的作用（P＜0.01）。

2.2.3 PB抑制phospho-Akt活性表達(dá) Western blot結(jié)果顯示（Fig 7），CHS模型組小鼠phospho-Akt（p-Akt）的蛋白表達(dá)水平較正常組明顯升高，PB干預(yù)后能夠下調(diào)Akt的磷酸化活性表達(dá)，同時(shí)，非磷酸化Akt表達(dá)無(wú)變化。

Fig 3 Effects of PB on spleen indexPB：pseudolaric acid B；Veh：CHS mouse model treated with saline；NOR：normal control.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vehicle

Fig 4 Hematoxylin and eosin（HE）staining（×100）A：Normal control；B：Veh；C，D，E：Pseudolaric acid B 5，10，20 mg·kg－1

3 討論

隨著工業(yè)化程度的逐步提高，自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病等由免疫反應(yīng)紊亂而引起的疾病也在不斷增加，嚴(yán)重危害廣大人民身心健康和生活質(zhì)量。免疫抑制劑可通過(guò)影響機(jī)體免疫應(yīng)答和免疫病理反應(yīng)，抑制免疫功能，從而發(fā)揮治療免疫反應(yīng)過(guò)度引起的相關(guān)疾病?；诖耍R床上根據(jù)個(gè)體情況合理選擇藥物，給免疫抑制劑提供了廣闊的市場(chǎng)。CHS是抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫應(yīng)答，參與多種炎癥免疫性疾病的致病機(jī)制。采用DNFB建立小鼠耳廓CHS模型是目前學(xué)界最常用的評(píng)價(jià)藥物免疫抑制活性的動(dòng)物模型之一。該模型以小鼠耳廓作為靶部位，根據(jù)炎癥耳廓的厚度來(lái)判斷藥物療效［7］。

傳統(tǒng)中藥土槿皮有止癢殺蟲(chóng)之功效，常用于治療皮膚癬癥、神經(jīng)性皮炎、濕疹等疾病，屬《中華人民共和國(guó)藥典》收載的常用中藥［1］。我們和其他研究人員均發(fā)現(xiàn)，PB能夠明顯抑制T淋巴細(xì)胞活化增殖，具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性［3，8］，本文在藥學(xué)分析的基礎(chǔ)上深入探討其可能的作用機(jī)制。首先建立小鼠CHS模型，口服給予不同劑量PB干預(yù)后，觀察其藥效學(xué)指標(biāo)。結(jié)果顯示，各劑量PB均明顯抑制CHS小鼠耳腫脹度，組織病理也顯示PB能使CHS炎癥反應(yīng)緩解，通過(guò)下調(diào)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

脾臟是產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所，其重量的改變能夠一定程度上反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中PB明顯降低CHS模型小鼠的脾臟指數(shù)，從另一個(gè)側(cè)面反映了藥物對(duì)機(jī)體免疫功能的抑制效應(yīng)。

Fig 5 PB modulated expression of PPARγPB：pseudolaric acid B；CHS：CHS mouse model treated with saline；NOR：normal control.**P＜0.01 vs CHS

Fig 6 Effects of PB on PPARγtranscriptional activity in HEK-293 cells

Fig 7 PB suppressed level of phosphorylated-AktPB：pseudolaric acid B；CHS：CHS mouse model treated with saline；NOR：normal control.**P＜0.01 vs CHS

過(guò)氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferater-activated receptor，PPAR）是一類(lèi)控制多種細(xì)胞和代謝過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子，包括PPARα、PPARβ／δ和PPARγ三種表型。其中，PPARγ在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及其它多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)，能夠與視黃醛X受體（RXR）形成異源二聚體，結(jié)合到位于靶基因啟動(dòng)子區(qū)的PPAR反應(yīng)元件（PPRE）。近年研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ具有負(fù)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用［9］，提示可以利用PPARγ的免疫抑制特性治療CHS介導(dǎo)的炎癥免疫性疾病。有報(bào)道顯示［1，10］，PB是 PPARγ的天然激動(dòng)劑，其活性高于現(xiàn)有合成的激動(dòng)劑。因此，我們首先檢測(cè)了富含淋巴細(xì)胞的脾臟中PPARγ的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果可見(jiàn)，PB能明顯上調(diào)PPARγ表達(dá)。由于PPARγ被激活后會(huì)引起一系列的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化，影響免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程［11］。因此，本研究進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)了PPARγ的轉(zhuǎn)錄激活情況，并證實(shí)PB能夠通過(guò)增加PPARγ表達(dá)和轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂，有望發(fā)展成為一種新型抗炎免疫調(diào)節(jié)劑。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是一類(lèi)高表達(dá)CD25的CD4＋T細(xì)胞，F(xiàn)oxp3是其的特異性功能基因，在Treg的表型、發(fā)育等功能中起決定性作用［12－13］。Akt信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、凋亡和分化等多種細(xì)胞生物活動(dòng)密切相關(guān)，過(guò)度激活后可促進(jìn)細(xì)胞增殖，使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，或參與炎癥性疾病的發(fā)病過(guò)程。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)［14］，Akt信號(hào)通路在Treg細(xì)胞生長(zhǎng)分化中同樣能夠發(fā)揮重要作用，激活A(yù)kt通路會(huì)抑制Treg分化。葛圣林等［15］證實(shí)，抑制Akt信號(hào)通路可使 Foxp3表達(dá)增強(qiáng)，且與Akt信號(hào)通路的激活程度呈負(fù)相關(guān)。我們前期發(fā)現(xiàn)，PB明顯增加CHS小鼠CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn) Foxp3基因表達(dá)［3，12］。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察到，CHS模型小鼠升高的Akt磷酸化活性表達(dá)能夠被PB抑制，提示通過(guò)調(diào)節(jié)Akt信號(hào)通路，進(jìn)而影響Treg細(xì)胞分化可能是PB發(fā)揮效應(yīng)的重要機(jī)制之一。

綜上所述，PB可能通過(guò)促進(jìn)PPARγ表達(dá)與轉(zhuǎn)錄激活、抑制Akt活化，增加Treg產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。但是，PB活化 PPARγ、抑制Akt信號(hào)通路、以及增加Treg三者之間究竟發(fā)揮怎樣的交互聯(lián)系尚需進(jìn)一步研究闡明。深入探討PB免疫調(diào)節(jié)的具體機(jī)制不但對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥、誘導(dǎo)免疫耐受等方面具有積極意義，還可能發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)，并為新型抗炎免疫調(diào)節(jié)劑的研制提供思路。

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