周玲玲，魏 偉，柳璋璞，周 聰，劉天陽，周學(xué)平

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210023；2.安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，安徽合肥 230032）

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以累及周圍關(guān)節(jié)為主的炎癥性自身免疫病，其致殘原因主要為關(guān)節(jié)畸變。關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞是關(guān)節(jié)畸變的重要因素，因此，治療RA的最大課題就是控制骨損傷。

破骨細胞是引起RA骨破壞的關(guān)鍵細胞之一［1］，在其分化過程中滑膜成纖維細胞起著重要作用［2］，通過釋放白介素（interleukin，IL）-1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，MCSF）等多種細胞因子，進而誘導(dǎo)破骨細胞分化因子（osteoclast differentiation factor／receptor activator of NF-κB ligand，ODF／RANKL）的表達［3］。RANKL和M-CSF作為刺激破骨前體細胞融合和分化成熟的關(guān)鍵因子，啟動多種引起特定基因表達和轉(zhuǎn)錄的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［4－5］。其中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路日益受到關(guān)注，它包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinases， ERKs）、p38MAPK、Jun-N末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）等，而炎癥性細胞因子是MAPK通路活化的誘導(dǎo)劑［6］，細胞因子和信號通路交互影響，介導(dǎo)破骨細胞分化，導(dǎo)致骨破壞的發(fā)生。課題組圍繞RA滑膜炎癥和骨質(zhì)破壞的內(nèi)在聯(lián)系，成功建立了佐劑關(guān)節(jié)炎（adjuvant induced arthritis，AIA）大鼠滑膜成纖維細胞和外周血單核細胞共培養(yǎng)誘生破骨細胞的模型，證實了細胞因子網(wǎng)絡(luò)和信號通路在破骨細胞分化過程中的作用［7］。因此，調(diào)控參與破骨細胞分化的細胞因子和信號通路，可有效延緩骨破壞的發(fā)生與發(fā)展。

白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是從亳白芍干燥根中提取的有效部位，主要成分為芍藥苷等。在前期的系列研究中證實了TGP對RA的治療作用，可調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，調(diào)控MAPKs途徑而減輕滑膜炎癥［8－9］。TGP的不良反應(yīng)少，長期使用病人耐受性好，可延緩骨質(zhì)破壞的發(fā)生與發(fā)展，但其干預(yù)RA骨質(zhì)破壞的機制尚未系統(tǒng)研究。因此，本項研究運用共培養(yǎng)誘生破骨細胞的模型，探討TGP在破骨細胞分化過程中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠，♂，180～220 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，合格證號：SYXK（蘇）2007－0030。

1.2 藥品與試劑 白芍總苷（TGP）：由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所提供。Ⅱ型膠原酶、噻唑藍［3-（4，5-dimethylthiazal-zyl）2，5-diphenyltetra-zolium bromide，MTT］：Sigma公司。胰蛋白酶：Amresco公司。dNTP混合液、PCR緩沖液、Taq聚合酶、100 bp DNA Ladder：天根生化科技有限公司。淋巴細胞分離液：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。Transwell細胞小室：Corning公司。牙質(zhì)片層：IDS Ltd產(chǎn)品。TRIzol：Invitrogen life technologies公司。MOPS、Tris-HCl、EDTA：華美生物工程公司。GAPDH引物：F：5′-GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3′， R： 5′-AAGGTG GAAGAATGGGAGTT-3′；ERK1引物：F：5′-GACCA GAGTGGCTATCAAGAAGA-3′，R：5′-GGATGTCTCG GATGCCTATG-3′；p38引 物：F：5′-GGGACCTCCT TATAGACGAATG-3′，R：5′-TGAAGTGGGATGGAC AGAACA-3′；JNK1引物：F：5′-GGAGGAGCGAACTA AGAATGG-3′，R：5′-AGACTGCTGTCTGTATCCGAG G-3′。

1.3 主要儀器 680型全自動酶標儀：Bio-Rad。3111型CO2培養(yǎng)箱：FORMA SCIENTIFIC。IX71相差顯微鏡：Olympus。掃描電鏡：Rotor-Gene 3000。Real time PCR儀：Corbett Research。引物設(shè)計軟件（Primer 5.0 Rotor-gene 6.0）：Corbett Research。

1.4 AIA大鼠滑膜成纖維細胞與單核細胞共培養(yǎng)模型的建立［7］按照前期建立的方法，SD大鼠30只，建立AIA大鼠模型，28 d后取大鼠新鮮抗凝血，分離外周血單核細胞；處死大鼠，無菌取滑膜組織，組織塊貼壁培養(yǎng)獲得滑膜成纖維細胞。24孔培養(yǎng)板內(nèi)加入109cells·L－1單核細胞，將傳代至3～5代的滑膜成纖維細胞制備成108cells·L－1細胞懸液，加入置于24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)的懸掛式培養(yǎng)小室中，5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3周后進行TRAP染色鑒定。

1.5 TGP對共培養(yǎng)誘生的破骨細胞增殖的影響共培養(yǎng)2周的破骨細胞中加入5、50、500、5 000 mg·L－1和 50 g·L－1的 TGP，5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，以MTT法檢測各孔A值。

1.6 TGP對共培養(yǎng)誘生的破骨細胞TRAP活性的影響 共培養(yǎng)2周的破骨細胞中，分別加入5、50、500、5 000 mg·L－1和 50 g·L－1的 TGP，5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取各孔上清，檢測TRAP活性。

1.7 TGP對破骨細胞所致骨吸收陷窩面積的影響

消化共培養(yǎng)2周的下層破骨細胞，加入預(yù)置象牙片的96孔板，濃度為 107cells·L－1，5%CO2、37℃培養(yǎng)24 h后，將5、50、500、5 000 mg·L－1和 50 g·L－1的 TGP分別加入各孔，5%CO2、37℃培養(yǎng) 48 h，換液后繼續(xù)培養(yǎng)3 d，取出骨片，掃描電鏡觀察骨片破骨細胞吸收陷窩，Leica圖像分析儀計算骨吸收陷窩的面積。

1.8 TGP對共培養(yǎng)系統(tǒng)上清液中細胞因子的影響

共培養(yǎng)細胞1周后，系統(tǒng)中加入5、50、500、5 000 mg·L－1和 50 g·L－1的 TGP，5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取各孔上清，ELISA法檢測上清中IL-1、TNF-α、M-CSF、RANKL的水平。

1.9 TGP對共培養(yǎng)破骨細胞分化中MAPKs通路的影響 滑膜成纖維細胞與單核細胞共同培養(yǎng)1周后，將50、500、5 000 mg·L－1的 TGP分別加入各孔，5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集分化的破骨細胞，加入TRIzol，提取總RNA，定量PCR檢測JNK、ERK、p38的表達。每個待測的基因和管家基因GAPDH進行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物梯度稀釋進行real time PCR反應(yīng)：95℃，5 min；40個 PCR循環(huán)（95℃，10 s；59℃，15 s；72℃，20 s；83.5℃，5 s）。反應(yīng)結(jié)束后進行結(jié)果分析，每個樣品的目的基因濃度除以管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，采用SPSS 11.5軟件包進行單因素方差分析比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 共培養(yǎng)破骨細胞形態(tài)學(xué)觀察 加入培養(yǎng)的AIA大鼠滑膜成纖維細胞至懸掛小室中，細胞很快貼壁生長并連接成片。底層的單核細胞逐漸分化，約2～3周，形成破骨細胞樣形態(tài)。TRAP染色為陽性細胞，掃描電鏡顯示其具備骨吸收功能（Fig 1）。

2.2 TGP對共培養(yǎng)誘生的破骨細胞增殖反應(yīng)的影響 Tab 1結(jié)果顯示，TGP 5 mg·L－1給藥對破骨細胞的增殖能力有抑制趨勢，但較對照組差異無顯著性；TGP 50、500、5 000 mg·L－1可不同程度抑制共培養(yǎng)誘生的破骨細胞的增殖，與對照組比較差異有顯著性（P＜0.05，0.01）；TGP 50 g·L－1的抑制作用也較明顯（P＜0.01），但較5 000 mg·L－1略有下降。提示TGP抑制破骨細胞的作用只在一定范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

Fig 1 Monocytes of AIA rats co-cultivated with synovial fibroblasts for 21 daysA：osteoclasts（100×）；B：TRAP-positive cells（100×）；C：bone resorption（600×）

Tab 1 Effects of TGP on proliferation of co-cultured osteoclasts±s，n＝8）

Tab 1 Effects of TGP on proliferation of co-cultured osteoclasts±s，n＝8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group Dose／mg·L－1Proliferation／A Control － 0.459±0.038 TGP 5 0.387±0.062 50 0.321±0.046*500 0.226±0.040**5 000 0.186±0.047**50 000 0.220±0.045**

2.3 TGP對共培養(yǎng)誘生的破骨細胞TRAP活性的影響 Tab 2結(jié)果顯示，TGP 5 mg·L－1給藥對破骨細胞的TRAP活性影響不明顯；TGP 50、500、5 000 mg·L－1給藥可濃度依賴性地抑制共培養(yǎng)誘生的破骨細胞的TRAP活性，與對照組比較差異有顯著性（P＜0.01）；TGP 50 g·L－1給藥亦可明顯抑制TRAP活性（P＜0.01），但作用較 5 000 mg·L－1略有下降。

2.4 TGP對共培養(yǎng)誘生的破骨細胞骨吸收的影響Tab 3結(jié)果顯示，TGP 5 mg·L－1對破骨細胞所致骨吸收陷窩面積的影響不明顯；TGP 50、500、5 000 mg·L－1給藥可濃度依賴性地抑制骨吸收陷窩面積，與對照組比較差異有顯著性（P＜0.05，0.01）；TGP 50 g·L－1也可明顯抑制破骨細胞骨吸收面積（P＜0.01），但作用較5 000 mg·L－1略有下降。

2.5 TGP對共培養(yǎng)系統(tǒng)上清中細胞因子水平的影響 Tab 4結(jié)果顯示：TGP 5 mg·L－1給藥對上清中細胞因子水平影響不明顯；TGP 50、500、5 000 mg·L－1給藥可濃度依賴性地抑制共培養(yǎng)系統(tǒng)上清液中IL-1、TNF-α、M-CSF、RANKL的水平，與對照組比較差異有顯著性（P＜0.05，0.01）。TGP 50 g·L－1也可明顯抑制上述細胞因子水平（P＜0.01），其作用與 5 000 mg·L－1相當。

2.6 TGP對共培養(yǎng)破骨細胞MAPKs表達的影響

Tab 5結(jié)果顯示：TGP 500、5 000 mg·L－1給藥可明顯抑制共培養(yǎng)系統(tǒng)破骨細胞的ERK1、JNK1、p38的表達，且抑制作用與TGP濃度成正比，與對照組比較差異有顯著性（P＜0.05，0.01）。

Tab 2 Effects of TGP on activity of TRAP of co-cultured osteoclasts（±s，n＝8）

Tab 2 Effects of TGP on activity of TRAP of co-cultured osteoclasts（±s，n＝8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group Dose／mg·L－1 TRAP／U·L－1 Control － 6.56±1.72 TGP 5 5.42±0.89 50 4.31±0.76*500 3.17±0.65**5 000 2.32±0.61**50 000 3.35±0.57**

Tab 3 Effects of TGP on bone resorption functions of co-cultured osteoclasts（±s，n＝4）

Tab 3 Effects of TGP on bone resorption functions of co-cultured osteoclasts（±s，n＝4）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group Dose／mg·L－1 Resorption area／μm2 Control － 20.31±3.35 TGP 5 17.26±3.17 50 11.37±2.18*500 7.75±2.40**5 000 3.17±2.59**50 000 5.96±2.21**

3 討論

在RA骨破壞的過程中，破骨細胞的過度增殖打破了成骨細胞和破骨細胞之間的平衡狀態(tài)，骨質(zhì)破壞隨之發(fā)生［10］。課題組前期采用AIA大鼠滑膜成纖維細胞作為基質(zhì)細胞，外周血單核細胞作為破骨細胞前體細胞，兩種細胞分別獨立培養(yǎng)，但培養(yǎng)液可以互通，成功誘導(dǎo)出破骨樣細胞。在共培養(yǎng)的過程中不需要添加外源性刺激因子，這提示滑膜成纖維細胞所分泌的細胞因子可刺激破骨前體細胞分化為破骨細胞。因此，這種共培養(yǎng)的方式可以更好地體現(xiàn)RA的病理過程，適合于藥物的作用機制研究。

TGP治療RA的療效確切，可緩解RA骨破壞進程［11］，因此，本課題進一步研究其干預(yù)骨破壞的機制。在建立上述共培養(yǎng)誘生破骨細胞模型的基礎(chǔ)上觀察TGP的作用，結(jié)果顯示：一定劑量的TGP可以抑制破骨樣細胞的分化增殖，抑制其TRAP活性，降低其骨吸收能力，說明TGP可以抑制破骨細胞的分化和活性。

細胞因子網(wǎng)絡(luò)在破骨細胞分化的過程中起著重要作用?，F(xiàn)普遍認為 M-CSF、RANKL、TNF-α、IL-1是重要的正調(diào)控因素［12］，滑膜成纖維細胞可分泌過量的細胞因子，進而通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響破骨細胞分化、活化的多個環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果顯示：一定劑量的TGP可明顯抑制共培養(yǎng)系統(tǒng)中上述細胞因子的分泌，這提示抑制滑膜成纖維細胞分泌與細胞分化和活化相關(guān)的細胞因子，可能是TGP抑制破骨細胞的一個重要機制。

破骨細胞的分化受到很多因素的影響，MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也是一個重要的調(diào)節(jié)途徑。活化的ERK、JNK、p38 MAPK能刺激破骨細胞前體的分化、生存、融合及活化成熟的破骨細胞［3，13］。我們前期的研究結(jié)果也證實MAPKs在共培養(yǎng)誘生破骨細胞過程中的作用［7］。本研究結(jié)果顯示：一定劑量的TGP可抑制上述破骨細胞ERK、JNK、p38蛋白的表達，說明抑制MAPKs信號途徑也是TGP抑制破骨細胞分化和活性的途徑之一。IL-1和TNF-α被看作為“上游”的細胞因子，可誘導(dǎo)產(chǎn)生“下游”的細胞因子，共同促進破骨細胞前體增殖、分化形成破骨細胞，加速骨吸收，它們對RANKL和MAPKs通路的活化亦具有明顯促進作用［6，14］。另外，RANKL和M-CSF也可促進 MAPKs的活化［15］，因此，TGP對MAPKs通路的抑制作用還可能與抑制上述細胞因子的分泌而干預(yù)MAPKs蛋白的活化密切相關(guān)。

研究中還發(fā)現(xiàn)，TGP對RA破骨細胞的抑制作用與劑量呈明顯相關(guān)，在TGP 50～5 000 mg·L－1具有較好的抑制作用，且具有良好的劑量－效應(yīng)關(guān)系，TGP濃度達到50 g·L－1時抑制作用不再增強或有所減弱，提示 TGP 50～5000 mg·L－1是抑制RA破骨細胞分化的最適濃度。

上述結(jié)果提示：一定劑量的TGP可明顯抑制RA破骨細胞的分化和活性，其作用與抑制滑膜成纖維細胞過度分泌細胞因子，進而阻止MAPKs信號途徑的活化有關(guān)。

Tab 4 Effects of TGP on levels of cytokines in supernatant of co-cultured osteoclasts（±s，n＝4）

Tab 4 Effects of TGP on levels of cytokines in supernatant of co-cultured osteoclasts（±s，n＝4）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group Dose／mg·L－1 IL-1／mg·L－1 TNF-α／mg·L－1 M-CSF／mg·L－1 RANKL／mg·L－1 Control － 458.11±51.63 156.50±25.02 16.25±1.94 30.24±4.99 TGP 5 384.59±66.40 127.25±12.15 13.16±1.35* 24.99±6.18 50 360.22±31.46* 97.25±12.44* 11.97±1.79** 16.74±4.25*500 313.49±21.32** 79.00±9.35** 7.81±1.67** 12.49±4.74**5 000 240.24±27.57** 54.25±11.05** 5.72±2.65** 7.95±2.15**50 000 236.87±31.11** 55.50±10.26** 5.35±2.55** 7.57±2.53**

Tab 5 Effects of TGP on expression of ERK，p38 and JNK expression in co-cultured osteoclasts（±s，n＝3）

Tab 5 Effects of TGP on expression of ERK，p38 and JNK expression in co-cultured osteoclasts（±s，n＝3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group ERK1／GAPDH p38／GAPDH JNK1／GAPDH Control － 0.483±0.096 0.145±0.005 0.335±0.0 Dose／mg·L－1 36 TGP 50 0.369±0.016 0.131±0.003 0.258±0.026 500 0.248±0.053* 0.121±0.010* 0.138±0.018**5000 0.213±0.020**0.073±0.019**0.091±0.033**

參考文獻：

［1］ Boyle W J，Simonet W S，Lacey D L.Osteoclast differentiation and activation［J］.Nature，2003，423（6937）：337－42.

［2］ Bartok B，F(xiàn)irestein G S.Fibroblast-like synoviocytes：key effector cells in rheumatoid arthritis［J］.Immunol Rev，2010，233（1）：233－55.

［3］ Edwards J R，Mundy G R.Advances in osteoclast biology：old findings and new insights from mouse models［J］.Nat Rev Rheumatol，2011，7（4）：235－43.

［4］ Lu SY，Li M T，Lin Y L.Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis［J］.Mol Biol Cell，2010，21（10）：1763－71.

［5］ Crotti T N，F(xiàn)lannery M，Walsh N C.NFATcl regulation of the humanβ3 integrin promoter in osteoclast differentiation［J］.Gene，2006，372（5）：92－102.

［6］ Nakamura I，Kadono Y，Takayanagi H，et al.IL-1 regulates cy-toskeletal organization in osteoclasts via TNF receptor-associated factor 6／c-Src complex［J］.J Immunol，2002，168（10）：5103－9.

［7］ 周玲玲，柳璋璞，周 聰，等.清絡(luò)通痹顆粒通過MAPKs信號通路干預(yù)共培養(yǎng)誘生的破骨樣細胞的分化［J］.中國免疫學(xué)雜志，2013，29（12）：1235－9.

［7］ Zhou L L，Liu Z P，Zhou C，et al.Influence of MAPK pathways on co-cultured osteoclasts differentiation and effects of Qingluotongbi granule on MAPK expressions［J］.Chin J Immunol，2013，29（12）：1235－9.

［8］ 吳華勛，陳鏡宇，汪慶童，等.白芍總苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜β抑制蛋白的影響與其抑制滑膜細胞增殖的關(guān)系［J］.中國藥理學(xué)通報，2012，28（7）：934－7.

［8］ Wu H X，Chen J Y，Wang Q T，et al.Relationship between the effects of total glucosides of paeony on expression ofβ-arrestins and inhibition on synoviocyte proliferation from CIA rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（7）：934－7.

［9］ Zhang L L，Wei W，Wang N P，et al.Paeoniflorin suppresses inflammatory mediator production and regulates G protein-coupled signaling in fibroblast-like synoviocytes of collagen induced arthritic rats［J］.Inflamm Res，2008；57（8）：388－95.

［10］Hayer S，Redlich K，Korb A，et al.Tenosynovitis and osteoclast formation as the initial preclinical changes in a murine model of inflammatory arthritis［J］.Arthritis Rheum，2007，56（1）：79－88.

［11］賈 敏，張 寒，楊 穎，王多寧.白芍總昔對關(guān)節(jié)炎大鼠骨質(zhì)破壞及T細胞表達RANKL的影響［J］.中藥藥理與臨床，2012，8（6）：62－5.

［11］Jia M，Zhang H，Yang Y，Wang D N.Effect of TGP on receptor activator of bone destruction and RANKL expression in T lymphocytes from arthritis rats［J］.Pharmacol Clin Chin Mat Med，2012，8（6）：62－5.

［12］ Takayanagi H.Osteoimmunology： shared mechanisms and crosstalk between the immune and bone systems［J］.Nat Rev Immunol，2007，7（4）：292－304.

［13］Wei S，Siegal G P.p38 MAPK as a potential therapeutic target for inflammatory osteolysis［J］.Adv Anat Pathol，2007，14（1）：42－5.

［14］Rossa C，Ehmann K，Liu M，et al.MKK3／6-p38 MAPK signaling is required for IL-1beta and TNF-alpha-induced RANKL expression in bone marrowstromal cells［J］.Interferon Cytokine Res，2006，26（10）：719－29.

［15］周四桂，袁 茜，潘雪刁，等.ERK1／2和 p38MAPK介導(dǎo)BAPTA-AM抑制RANKL誘導(dǎo)小鼠骨髓巨噬細胞分化的機制研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26（9）：1146－50.

［15］Zhou SG，Yuan Q，Pan X D，et al.ERK 1／2 and p38 MAPK mediate the effect of BAPTA-AM inhibiting RANKL induced bone marrow macrophages differentiation［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（9）：1146－50.