謝英花，馬燕山，張 楠，張建新

（1.河北科技大學(xué)藥學(xué)系，河北 石家莊 050018；2.石家莊市中醫(yī)院放射科，河北 石家莊 050051；3.河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，河北石家莊 050021）

心肌缺血性損傷嚴(yán)重危害人類健康，是由冠狀動(dòng)脈供血不足，心肌急劇的暫時(shí)的缺血和缺氧引起。若不及時(shí)處理，可誘發(fā)心絞痛及心肌梗死。研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血、缺血／再灌注損傷、心力衰竭等的重要病理生理機(jī)制［1－3］。據(jù)報(bào)道，硫化氫（H2S）可調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡［2，4－5］。但是，其對(duì)離體灌流大鼠急性心肌缺血所致細(xì)胞凋亡的作用尚未見報(bào)道。為此，本研究觀察外源性H2S對(duì)離體灌流大鼠急性心肌缺血所致細(xì)胞凋亡的影響，為心肌缺血性損傷的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 NaHS、苯甲基磺酰氟（PMSF）、過(guò)硫酸 胺 （APS）、N，N，N，N-四 甲 基 乙 二 胺（TEMED）、甘氨酸、PVDF膜均購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；兔caspase-3多克隆抗體、小鼠Cyt-C單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；RIPA組織／細(xì)胞裂解液、N，N-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞核蛋白／漿蛋白抽提試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；預(yù)染蛋白Marker、BCA法蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；TUNEL試劑盒（In situ cell death detection kit-POD）購(gòu)自美國(guó)Roche公司。

1.2 儀器 高速冷凍離心機(jī)1-15k（美國(guó)Sigma公司）；T-05X20-2A凝膠掃描分析系統(tǒng)（法國(guó)VL公司）；水平電泳儀、水浴電轉(zhuǎn)膜儀（北京市六一儀器廠）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；石蠟切片機(jī)、撈片機(jī)（德國(guó)Leica公司）

1.3 模型制備及動(dòng)物分組 健康♂SD大鼠40只（SPF級(jí)），體質(zhì)量250～290 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠腹腔注射10%水合氯醛350μg·g－1麻醉后，迅速開胸，取出心臟，置于盛有混合氣飽和預(yù)冷K-H液的平皿中，清洗殘留血液，經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管，懸掛于Langendorff灌注裝置，混合氣飽和的K-H液恒壓灌注。平衡20 min后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，引起心肌急性缺血。

將動(dòng)物隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（Sham組，冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線但不結(jié)扎，其余操作同Ischemia組）、缺血組（Ischemia組，冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎4 h，正常灌流液灌流）、NaHS5、10、20μmol·L－1后處理劑量組（冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎2 h時(shí)更換為5、10、20μmol·L－1NaHS的灌流液，其余操作同Ischemia組）。

1.4 心肌組織病理學(xué)分析 心臟灌流結(jié)束后，摘取心臟，沖凈，取左心室前壁組織，在質(zhì)量濃度為100 g·L－1的多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水，浸蠟包埋，制成光鏡切片，蘇木精－伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理性損傷改變。

1.5 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 上述心肌組織石蠟切片采用TUNEL法（脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)記染色。光鏡可見凋亡細(xì)胞核染成棕褐色，高倍鏡下每張切片隨機(jī)取5個(gè)以上視野，計(jì)算凋亡百分率。

1.6 Western blot法半定量測(cè)定心肌組織中caspase-3、Cyt-C蛋白表達(dá) 分別處理心肌組織，提取得到心肌組織中總蛋白（測(cè)定Cyt-C）和漿蛋白（測(cè)定caspase-3）。將所得心肌組織總蛋白或漿蛋白樣品與上樣緩沖液熱變性，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用 TBST洗滌，5%脫脂奶粉封閉，加稀釋的caspase-3、Cyt-C一抗，再加相應(yīng)的二抗，ECL顯色，掃描條帶，轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像，Image J圖像分析軟件半定量分析蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變 光鏡下可見Sham組心肌肌原纖維完整，排列整齊，無(wú)水腫、變性壞死等改變，心肌組織結(jié)構(gòu)正常；Ischemia組存在局灶性病變，明顯變性壞死，水腫及炎性浸潤(rùn)，心肌纖維呈波浪樣改變，排列紊亂，部分?jǐn)嗔?；而NaHS 5、10、20μmol·L－1后處理劑量組呈劑量依賴性地減輕心肌組織損傷的病理學(xué)改變（Fig 1）。

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率的變化 如Fig 2所示，Ischemia組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，凋亡率（24.36±1.56）%明顯高于 Sham組（9.83±1.26）%（P＜0.01），NaHS 10、20μmol·L－1后處理劑量組細(xì)胞發(fā)生凋亡水平降低，凋亡率分別為（16.24±0.92）%、（13.29±0.78）%，明顯低于 Ischemia組（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠心肌組織caspase-3和Cyt-C的蛋白表達(dá)情況 如Fig 3所示，與Sham組比較，Ischemia組Cyt-C和caspase-3的蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）。與 Ischemia組比較，NaHS 10、20μmol·L－1后處理劑量組caspase-3的蛋白表達(dá)減弱（P＜0.05或P＜0.01）；NaHS 5、10、20μmol·L－1后處理劑量組 Cyt-C的蛋白表達(dá)下降（P＜0.05或P＜0.01）。

Fig 1 Effects of H 2 S on the pathological changes of myocardial tissue in rats by optical microscope（HE×200）A：Sham；B：Ischemia；C：5μmol·L－1 NaHS；D：10μmol·L－1 NaHS；E：20μmol·L－1 NaHS

3 討論

H2S是繼NO和CO之后的又一種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。內(nèi)源性H2S是由半胱氨酸經(jīng)胱硫醚-β-合酶（CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）及 3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶（3MST）催化而產(chǎn)生，其中，CSE主要表達(dá)于血管組織和心肌中［6］。越來(lái)越多的研究表明，內(nèi)源性H2S或其供體如Na2S、NaHS可發(fā)揮廣泛的心血管保護(hù)效應(yīng)［2］。其中，H2S對(duì)心肌凋亡具有廣泛的拮抗效應(yīng)，可明顯抑制氯化鈷或糖尿病心肌損傷引起的心肌 caspase-3活化、心肌細(xì)胞凋亡率升高［7－8］。研究證實(shí)，H2S對(duì)缺氧／復(fù)氧（H／R）心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用與拮抗線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道開放有關(guān)［9］。此外，在糖尿病大鼠心肌缺血／再灌注損傷中，H2S可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞凋亡基因fas、fas配體（FasL）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)，阻斷細(xì)胞表面死亡受體途徑，發(fā)揮其保護(hù)作用［10］。

Fig 2 Apoptotic rate of myocardial cell byTUNEL assay in rats（×200）A：Sham；B：Ischemia；C：5μmol·L－1 NaHS；D：10μmol·L－1 NaHS；E：20μmol·L－1NaHS.**P＜0.01 vs sham group；＃＃P＜0.01 vs ischemia group

細(xì)胞凋亡可能是心肌細(xì)胞損傷中的重要環(huán)節(jié)之一，抑制細(xì)胞凋亡便能明顯縮小心肌梗死的面積［3，11－12］。本文通過(guò) TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，缺血 4 h后，Ischemia組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于Sham組（P＜0.01），證實(shí)了缺血損傷可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生。而 NaHS 10、20μmol·L－1后處理劑量組細(xì)胞凋亡率明顯低于 Ischemia組（P＜0.01），說(shuō)明NaHS后處理具有抑制缺血損傷所致心肌細(xì)胞凋亡的作用，光鏡下心肌組織病理學(xué)改變也充分顯示了這一點(diǎn)。NaHS后處理可明顯逆轉(zhuǎn)缺血所致的心肌纖維、細(xì)胞膜、細(xì)胞核等的結(jié)構(gòu)改變。由上可見，NaHS后處理對(duì)離體灌流大鼠急性心肌缺血損傷有保護(hù)作用，且和其抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

凋亡機(jī)制的研究是現(xiàn)代心臟病學(xué)的研究重點(diǎn)。多基因參與介導(dǎo)調(diào)控的細(xì)胞凋亡主要涉及死亡受體通路和線粒體凋亡通路兩條通路［13］。Caspase家族負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行，通過(guò)相應(yīng)caspase基因的逐層激活，引起細(xì)胞的凋亡。在此級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，caspase-3為關(guān)鍵性蛋白酶，caspase-3被上游信號(hào)激活后可作用于其底物，使級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，引起細(xì)胞凋亡。在線粒體凋亡通路中，線粒體腫脹、膜流動(dòng)性降低、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，可促進(jìn)細(xì)胞色素C（Cyt-C）等的釋放，激活上游caspase蛋白酶，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡［3，8，12－13］。本文通過(guò) Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ischemia組 Cyt-C和 caspase-3的蛋白表達(dá)均比Sham組增強(qiáng)（P＜0.01），而 NaHS后處理劑量組Cyt-C的蛋白表達(dá)比Ischemia組減弱（P＜0.05或P＜0.01），NaHS 10、20μmol·L－1后處理劑量組caspase-3的蛋白表達(dá)比Ischemia組減弱（P＜0.05或P＜0.01）。因此，NaHS后處理抑制心肌缺血損傷引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與下調(diào)Cyt-C、caspase-3的蛋白表達(dá)有關(guān)，但它對(duì)其他凋亡相關(guān)蛋白的作用及機(jī)制，尚需進(jìn)一步的深入研究。

Fig 3 Effects of H 2 S on the expression of caspase-3 and Cyt-C in myocardial tissue in rats by Western blotA：Sham；B：Ischemia；C：5μmol·L－1 NaHS；D：10μmol·L－1 NaHS；E：20μmol·L－1 NaHS.**P＜0.01 vs sham group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs ischemia group

我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)：離體急性缺血損傷心肌在給予NaHS后，離體心肌中CSE的活性和H2S的含量可不同程度上升，左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)明顯改善，心肌梗死體積明顯縮小，可使急性心肌缺血損傷減輕［14］。結(jié)合上述研究結(jié)果可知，離體心肌缺血后，外源性補(bǔ)充H2S，隨著心肌組織中H2S含量的升高，心肌組織中凋亡細(xì)胞減少，心肌缺血損傷減輕。從而表明H2S含量的變化對(duì)細(xì)胞凋亡起到重要的調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能與減輕心肌細(xì)胞凋亡，下調(diào)Cyt-C、caspase-3的蛋白表達(dá)有關(guān)。

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