吳 潔，吳紅海，于 洋，秦亞彬，韓曉磊，侯艷寧

（1.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院藥劑科，河北石家莊 050082；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，河北 石家莊 050017）

阿爾采末?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損傷為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。其典型病理改變?yōu)榈矸蹣影邏K形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元變性死亡和膠質(zhì)細(xì)胞過度增生活化。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的細(xì)胞類型，適度激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可胞吞Aβ蛋白，釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，保護(hù)神經(jīng)元；但過度激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過釋放神經(jīng)毒性的細(xì)胞因子和其他毒性物質(zhì)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，加速AD病理進(jìn)程。研究表明［1］，大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和其所分泌細(xì)胞因子的改變通常比AD的典型病理改變早10多年，在AD的發(fā)生、發(fā)展中有重要的作用。

孕酮（progesterone，PROG）是重要的天然孕激素之一，主要用于保護(hù)妊娠和婦科疾病的治療。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，孕酮還可作為神經(jīng)活性甾體，通過抑制炎癥反應(yīng)、抑制中樞興奮性毒性、抗氧化、抗缺血、抗凋亡、神經(jīng)營養(yǎng)、改善學(xué)習(xí)記憶等，對顱腦損傷及神經(jīng)退行性疾病發(fā)揮保護(hù)作用［2－4］。本文旨在研究孕酮在抑制Aβ1－42誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，保護(hù)神經(jīng)元中的作用及其機(jī)制，為孕酮在AD防治中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 新生SD大鼠，清潔級，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號：SCXK（冀）2008－1003］；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco）；Aβ1－42、PROG（Sigma）；IL-1β ELISA kit、TNF-α ELISA kit（Blue Gene）；NF-κB抗體（Cell Signal）；Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔二抗（中杉金橋）；Lamin A抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔／鼠IgG（Santa Cruz）；超凈臺(tái)（中國蘇凈集團(tuán)）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma）；電熱恒溫水浴鍋（科隆儀器設(shè)備廠）；倒置顯微鏡（上海精密儀器廠）；熒光顯微鏡及顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）；酶標(biāo)儀（德國BMG公司）；低溫離心機(jī)（Thermo）；電泳儀（北京六一廠）。

1.2 大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 取新生24 h SD大鼠，無菌條件下取大腦皮質(zhì)，剪碎，37℃水浴中胰酶消化15～20 min，含10%FBS的高糖DMEM終止消化。使用巴氏吸管吹散細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，每隔2～3 d全量更換培養(yǎng)液，至細(xì)胞基本融合。使用“二次震蕩法”純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP免疫熒光染色結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞純度超過95%。純化后星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)消化、重懸，以1×108·L－1密度接種于6孔板中，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)。

1.3 大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng) 參照本實(shí)驗(yàn)室已建立方法［5］，略有改進(jìn)。取新生24 h內(nèi)SD大鼠大腦皮質(zhì)部分，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，6 h后首次換液為含2%B27的neurobasal培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，48 h以后完全換液，此后，每2 d半量換液。取培養(yǎng)6～7 d的神經(jīng)元細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。

1.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)［6］方法，略有改進(jìn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)于孔底部含有4個(gè)約0.5 mm高石蠟小柱的6孔板中，石蠟小柱用于支撐載玻片；神經(jīng)元培養(yǎng)在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載破片上，培養(yǎng)7 d后，將載有神經(jīng)元的玻片放入石蠟小柱上，與星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、Aβ（5μmol·L－1Aβ1－42）組及Aβ加3個(gè)濃度PROG處理組 PL、PM、PH（0.01、0.1、1μmol·L－1PROG，各組同時(shí)加入 5μmol·L－1Aβ1－42），處理24 h，檢測炎癥因子的釋放、NF-κB的活性。將載有神經(jīng)元的玻片放入經(jīng)不同給藥處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行共培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液為 DMEM（不含 Aβ、PROG），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測共培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率。

1.6 MTT法 取出神經(jīng)元細(xì)胞爬片，放入24孔板中，每孔加入 40μl MTT（5 g·L－1），于 37℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔各加入300μl DMSO，混合均勻，酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞490 nm波長處的吸光度（OD值），以各組細(xì)胞吸光度與對照組吸光度的比值表示相對細(xì)胞存活率。

1.7 ELISA檢測 取各組細(xì)胞條件培養(yǎng)液，3 000 r·min－1離心 10 min，取上清，按試劑盒說明書操作，測定炎癥因子IL-1β和TNF-α的水平。

1.8 細(xì)胞免疫熒光分析 取各處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，兔源 p65（1∶100）4℃孵育過夜，二抗孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察。

1.9 Western blot分析 取各組星形膠質(zhì)細(xì)胞，冰上提取細(xì)胞核蛋白，等量蛋白提取液與上樣緩沖液混合，煮沸變性。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，100 mA濕轉(zhuǎn)，脫脂奶粉封閉，加兔源p65（1∶1 000）孵育過夜，TBS漂洗后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，ECL光化學(xué)法顯色，暗室中壓X線片顯影。X-線膠片經(jīng)掃描，應(yīng)用Image J圖像分析軟件對掃描圖上的條帶進(jìn)行相對定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果以ˉx±s表示，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析（one way ANOVA），繼以Dunnett t test對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 孕酮抑制Aβ1－42誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化所致神經(jīng)元損傷 MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元存活率下降，為對照組的70.1%（P＜0.05）。與Aβ組相比，PM、PH組神經(jīng)元存活率升高，分別為Aβ組的1.159倍和1.296倍 （P＜0.05）。孕酮抑制Aβ1－42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞引起的神經(jīng)元存活率下降，作用呈濃度依賴性，結(jié)果見Fig 1。

Fig 1 Effect of PROG treated Aβ1－42 activated astrocytes on viability of cultured cortical neurons＃P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs Aβgroup

Fig 2 Effect of PROG on release of inflammatory cytokines from Aβ1－42 activated astrocytes**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05 vs Aβgroup

2.3 PROG對 Aβ1－42誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞 NF-κB活性的影響 NF-κB主要功能性亞單位p65在細(xì)胞中的定位，反映NF-κB的活性。免疫熒光結(jié)果顯示，p65在對照組細(xì)胞的胞質(zhì)明顯表達(dá)，胞核無著色；Aβ

2.2 PROG對 Aβ1－42誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 ELISA結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ組條件培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平均升高（P＜0.01）；與 Aβ組相比，PM、PH組 IL-1β和 TNF-α的水平均下降（P＜0.05）；PL組 IL-1β和 TNF-α的水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。孕酮濃度依賴地抑制Aβ1－42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放，結(jié)果見Fig 2。組NF-κB被激活，p65在胞核明顯表達(dá)。隨孕酮濃度的增加，p65在胞核中的分布逐漸減少，胞質(zhì)中分布增多，孕酮濃度依賴地抑制Aβ1－42引起的p65核轉(zhuǎn)位，結(jié)果見Fig 3。

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ組星形膠質(zhì)細(xì)胞核提取液中 p65的表達(dá)增加（P＜0.01）。與 Aβ組相比，PM、PH組細(xì)胞核提取液中p65表達(dá)量降低（P＜0.01），低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。孕酮濃度依賴地抑制 Aβ1－42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB的活性，結(jié)果見Fig 4。

Fig 3 Effect of PROG on nuclear translocation of p65 in Aβ1－42 activated astrocytes observed under fluorescence microscope（400×）

Fig 4 Effect of PROG on p65 expression in nucleus of Aβ1－42 activated astrocytesA：The relative amounts of p65 levels were detected by Western blot analysis，lamin A was used as an internal control；B：Densitometric scanning.＃＃P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs Aβgroup.

3 討論

孕酮作為神經(jīng)活性甾體，發(fā)揮廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)、保護(hù)作用。首先，孕酮能夠增加神經(jīng)元在缺血損傷中的耐受性［7］，維持神經(jīng)元在Aβ?lián)p傷中的活性與功能［8］。也有研究表明，孕酮能夠通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，在急性腦損傷、脊髓損傷及痛風(fēng)模型中，發(fā)揮有效保護(hù)作用［9－11］。然而，孕酮作用與Aβ活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的影響，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)首次將孕酮作用于Aβ1－42活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察與其共培養(yǎng)神經(jīng)元存活率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ1－42活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)，使神經(jīng)元存活率明顯下降；孕酮能夠有效抑制Aβ1－42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞引起的神經(jīng)元存活率下降，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)信息處理、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控神經(jīng)和突觸可塑性，為神經(jīng)元提供營養(yǎng)和代謝支持［12］。然而，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種刺激，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增生，使其正常生理功能發(fā)生一系列變化，影響神經(jīng)元的活性。文獻(xiàn)報(bào)道［6］，Aβ作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，使其線粒體功能障礙，能量代謝異常；吞噬與清除Aβ功能受損，致Aβ蓄積［13］；谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)障礙，興奮性毒性物質(zhì)蓄積［6］；谷胱甘肽合成代謝障礙，過氧化產(chǎn)物蓄積［14］；釋放神經(jīng)毒性的細(xì)胞因子和其他毒性物質(zhì)等［15］。Aβ引起星形膠質(zhì)細(xì)胞代謝表型的改變，都在一定程度上誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡及AD的發(fā)生、發(fā)展。

實(shí)驗(yàn)從抑制炎癥反應(yīng)方面，研究孕酮發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。將不同濃度的孕酮處理Aβ1－42活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，孕酮有效降低Aβ1－42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α的水平，抑制NF-κB的活性，在一定程度上反映了孕酮對 Aβ1－42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制，作用呈濃度依賴性。炎癥因子IL-1β、TNF-α介導(dǎo)細(xì)胞炎癥級聯(lián)反應(yīng)；增加β-淀粉樣前體蛋白APP及其剪切酶BACE的表達(dá)，促進(jìn)Aβ的生成與釋放；作為死亡配體，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，在 AD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［16］。NF-κB作為基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等的調(diào)控過程，與許多基因啟動(dòng)子區(qū)域的固定核苷酸序列相結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，在多種疾病的發(fā)病過程中有重要作用［3，18］。因此，與Chen等［3］發(fā)現(xiàn)孕酮通過抑制 TLRs／NF-κB信號通路，減少IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)急性腦損傷作用相一致，本研究認(rèn)為，NF-κB信號通路在孕酮抑制Aβ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用中有重要意義。

綜合實(shí)驗(yàn)室前期孕酮對Aβ25－35誘導(dǎo)的阿爾采末病模型神經(jīng)元凋亡有保護(hù)作用的發(fā)現(xiàn)［5］，說明孕酮不僅能保護(hù)Aβ直接導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，還可通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化，發(fā)揮對神經(jīng)元的保護(hù)作用，對AD的預(yù)防和治療極具潛力。

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