陳鐘琳，姜紅巖，洪曉冰，陳中華，鄭燕珊，徐 涵，石剛剛，黃展勤

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東汕頭 515041）

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2），也稱作堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移、血管生成及腫瘤的發(fā)生等過(guò)程。FGF-2基因定位于人類染色體的4q26，全長(zhǎng)38kb，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。由于其mRNA有多個(gè)翻譯起始位點(diǎn)，可以產(chǎn)生18 ku的低分子量亞型（lo FGF2）和23 ku的高分子量亞型（hi FGF2），低分子量亞型在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中表達(dá)，高分子量亞型則主要直接進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮作用。具有活性的FGF-2可通過(guò)肝素硫酸鹽蛋白多糖（heparin sulfate proteoglycans，HSPG），與酪氨酸激酶受體性質(zhì)的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）結(jié)合，激活 PKC、Ras／Raf／MEK／ERK、P13K、JAK／STAT等信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化和惡性轉(zhuǎn)化［1－2］。

在心血管系統(tǒng)，有研究結(jié)果證明FGF-2參與了壓力負(fù)荷和血管緊張素引起的心肌肥厚［3］；AngⅡ與受體結(jié)合刺激心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞分泌FGF-2，并激活MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致心肌肥厚，心臟功能惡化［4－5］。但是，也有研究表明 FGF-2可以引起細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，抑制增殖和引起細(xì)胞凋亡［6］。顯然，F(xiàn)GF-2在心血管中的作用尚不完全明了。

為了進(jìn)一步研究hi FGF2的生物學(xué)意義及其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建 hi FGF2的真核表達(dá)載體，并在HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后，觀察其對(duì)HEK293細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 重組質(zhì)粒hi FGF2（23 ku）-pD-sRed1-N1（由德國(guó) Hannover大學(xué) Prof.Dr.Peter Claus饋贈(zèng)），HEK293細(xì)胞株（中國(guó)細(xì)胞庫(kù)），LipofectamineTM2000 Reagent（Invitrogen公司），E.coli Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金公司），Nhel限制性內(nèi)切酶、EcoRI限制性內(nèi)切酶（美津生物技術(shù)公司），膠回收試劑盒（天根生物技術(shù)公司），質(zhì)粒小提／中提試劑盒（BIOMIGA公司），高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（HyClone公司），Annexin V-FITC／PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Mbchem公司），兔抗大鼠FGF-2單克隆抗體（Epitomics公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分成3組：正常組（Control）、轉(zhuǎn)染空載體（Vector）組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（hi FGF2）組。

1.3 pDsRed1-N1真核表達(dá)載體的構(gòu)建 質(zhì)粒FGF2（23 ku）-pDsRed1-N1的 cDNA用 Nhel和 Eco-RI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳后根據(jù)載體DNA片段大小切膠（約4 700 bp），用膠回收試劑盒回收純化所切片段，得到少量載體DNA。載體DNA用感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在LB固體培養(yǎng)基中擴(kuò)增長(zhǎng)出菌落，最后用去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒抽提純化出質(zhì)粒DNA，即構(gòu)建出pDsRed1-N1真核表達(dá)載體。用Nhel和EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 FGF2在HEK293細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染 200 ml的DMEM（無(wú)血清）中加入4.0μg DNA，柔和混勻；200 μl／孔無(wú)血清 DMEM稀釋10μl／孔 lipofectamin 2000試劑，輕輕混勻，室溫放置5 min；將稀釋好的DNA和lipofectamin 2000試劑輕柔混勻，室溫放置20 min。將400μl上述復(fù)合物加入到細(xì)胞中，細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后可通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察到熒光，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.5 FGF2在HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后的檢測(cè)FGF2在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染48 h內(nèi)提取總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。一抗為兔抗FGF2單克隆抗體，二抗為羊抗兔多克隆抗體，化學(xué)發(fā)光液為底物。

1.6 檢測(cè)過(guò)表達(dá)hi FGF2后細(xì)胞凋亡 用Annexin V-FITC／PI雙染法細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)過(guò)表達(dá)hi FGF2后細(xì)胞凋亡的情況。pDsRed1-N1-hi FGF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞后24 h，用不含EDTA的胰酶消化收集，用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次2 000 r·min－1，5 min離心收集細(xì)胞；用400μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞；在細(xì)胞懸液中加入5μl Annexin VFITC，輕輕混勻避光孵育15 min；加入10μl PI后輕輕混勻避光孵育5 min；1 h內(nèi)用熒光顯微鏡檢測(cè)。細(xì)胞分組：陰性組，單染FITC組，單染 PI組，雙染FITC-PI組。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 HI FGF2的鑒定及真核表達(dá)載體的構(gòu)建HEK293細(xì)胞RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法得到約1 000 bp的DNA條帶，酶切克隆至pDsRed1-N1中，PCR擴(kuò)增hi FGF2質(zhì)粒在23 ku的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到含hi FGF2 cDNA的真核表達(dá)載體，條帶指示約在5500 bp和90 bp（Fig1）。DNA測(cè)序證實(shí)其全長(zhǎng)開放讀碼框與真核表達(dá)載體的讀碼框吻合，得到pDsRed1-N1-hi FGF2。

Fig 1 hi FGF2 plasmid and p DsRed1-N1 vector was detected by gel Agarose gel electrophoresis1：The hi FGF2-pDsRed1-N1 DNA，the bands are about 5 500bp and 90bp.2，3：The pDsRed1-N1 DNA，the band is about 5 000 bp.

2.2 熒光倒置顯微鏡觀測(cè)HI FGF2的轉(zhuǎn)染效率由于目的基因片段插入載體pDsRed1-N1中，且?guī)Ъt色熒光蛋白，所以進(jìn)行質(zhì)粒hi-FGF2-pDsRed1-N1轉(zhuǎn)染后，有質(zhì)粒轉(zhuǎn)入的細(xì)胞在熒光倒置顯微鏡下可觀測(cè)到紅色熒光，從而判斷質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率（Fig 2）。

Fig 2 Transfection of hi FGF2-pDsRed1-N1 in HEK293 cellsThe red fluorescence represents that hi FGF2-pDsRed1-N1 has been transfected into the HEK293 cells.

2.3 Western blot檢測(cè)HI FGF2在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) Westerm blot檢測(cè)pDsRed1-N1-hi FGF2轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中hi FGF2的表達(dá)，在約50 ku處出現(xiàn)了特異性免疫反應(yīng)條帶（Fig 3），而未經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照無(wú)相應(yīng)條帶，表明 hi FGF2成功轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中，并表達(dá)hi FGF2重組蛋白。

Fig 3 Over-expression of hi FGF2-pDsRed1-N1 in HEK293 cells1：Nomal cultured HEK293 cells；2：HEK293 cells which were transfected with hi FGF2-pDsRed1-N1.

2.4 表達(dá)HI FGF2引起細(xì)胞凋亡 FITC-Annexin V／PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在流式細(xì)胞散點(diǎn)分析圖上劃十字門，正常細(xì)胞FITC及PI均低染（FITCPI－），圖上顯示為左下區(qū)細(xì)胞簇；早期凋亡細(xì)胞FITC高染而PI低染（FITC＋PI－），圖上顯示為右下區(qū)細(xì)胞簇；晚期凋亡及死亡細(xì)胞FITC及PI均高染（FITC＋PI＋），圖上顯示為右上區(qū)細(xì)胞簇（Fig 4 A，B，C）。比較早期凋亡和晚期凋亡，空載體轉(zhuǎn)染組（Vector組）（Fig 4B）比正常未轉(zhuǎn)染組（Control組）（Fig 4A）凋亡細(xì)胞增多，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（Fig 4C）比正常未轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明當(dāng)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒 pDsRed1-N1-hi FGF2時(shí)，明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Fig 4 Over-expression of Hi-FGF2 induced cell apoptosisA：Normal cultured HEK293 cells（Control）；B：HEK293 cells which were transfected with empty vector pDsRed1-N1（Vector）；C：HEK293 cells which were transfected with hi FGF2-pDsRed1-N1（hi FGF2）.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs vector

3 討論

HEK293細(xì)胞是一種來(lái)源于人體腎臟的細(xì)胞株，且比較容易轉(zhuǎn)染，是一個(gè)很常用的研究表達(dá)外源基因的細(xì)胞株。綜合大量的文獻(xiàn)和前期研究，選擇HEK293細(xì)胞株作為初步研究轉(zhuǎn)染和生物活性的功能性細(xì)胞，是一個(gè)最佳選擇［7］。本實(shí)驗(yàn)選用HEK293細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)載體，并成功進(jìn)行 pD-sRed1-N1-hi FGF2的轉(zhuǎn)染，為研究hi FGF2的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

已有研究表明，hi FGF2過(guò)表達(dá)會(huì)使半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶3（caspase-3）活化，同時(shí)下調(diào)Akt磷酸化水平。Miyamoto等［8］指出，多種病理?yè)p傷，包括缺血和再灌注、壓力超負(fù)荷、缺氧、低血糖和心臟毒性藥物能夠激活A(yù)kt，阻止心肌細(xì)胞凋亡。Akt磷酸化水平一旦降低，其促細(xì)胞存活的作用也將隨之降低，加上執(zhí)行caspase-3的激活，標(biāo)志細(xì)胞凋亡的引發(fā)［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí) hi FGF2轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞過(guò)表達(dá)后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒hi FGF2-pDsRed1-N1的成功構(gòu)建，為我們的下一步深入研究提供有利的實(shí)驗(yàn)條件。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步擴(kuò)展研究hi FGF2導(dǎo)致細(xì)胞凋亡可能的作用機(jī)制，如對(duì)細(xì)胞中Akt磷酸化水平的影響，以及B23、p68、C1QBP等多種蛋白質(zhì)的相互作用后所產(chǎn)生的生物效應(yīng)。

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