陽群芳，雷文娟，魏玉玲，胡馨月，紀超男，楊 洋，匡勝男，麥少珊，楊俊卿

（重慶醫(yī)科大學藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016）

鋁是地殼中分布最廣、含量第三的金屬元素，在日常生活中具有廣泛的用途，如化妝品、食品添加劑、醫(yī)藥產品、炊具、飲用水容器以及建筑材料等，但其生理功能尚未完全清楚［1］。早在1973年，Crapper等［2］通過貓腦室內注射鋁鹽，發(fā)現(xiàn)鋁具有明顯的神經毒性，表現(xiàn)為神經纖維變性、神經細胞死亡。低劑量鋁并不會產生明顯毒性癥狀，僅在蓄積到一定量時才表現(xiàn)出來。鋁易沉積于腦內，對中樞神經系統(tǒng)產生明顯毒性，如阿爾采末病、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥。其中，鋁與阿爾采末病的關系研究較為廣泛［3－4］。

前列腺素 I2（prostaglandin I2，PGI2），又叫前列環(huán)素，是1976年發(fā)現(xiàn)的一種由血管內皮細胞合成的血管活性物質，由環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）及前列環(huán)素合酶（prostacyclin synthase，PGIS）共同催化花生四烯酸（AA）而生成的前列腺素（prostaglandins，PGs）產物。PGI2通過激活前列環(huán)素受體（prostacyclin receptor，IP）而發(fā)揮廣泛的生物學效應，但PGI2化學性質不穩(wěn)定，半衰期短，在體內的半衰期只有3～5 min［5］，藥理作用十分有限。貝前列素鈉（beraprost sodium，BPS）為首個可口服的PGI2類似物，為前體藥物。已有的關于PGI2及其類似物的研究報道多集中在心血管方面，而PGI2在神經元中的表達及作用的研究相對較少。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，BPS對全腦缺血／再灌注（global cerebral ischemia reperfusion，GCIR）大鼠具有明顯的腦保護作用，其機制可能涉及到PGIS-IP信號通路的平衡［6］。那么，BPS對慢性鋁過負荷大鼠是否具有腦保護作用呢？其機制是否同樣涉及到PGIS-IP信號通路呢？

本研究通過建立大鼠慢性鋁過負荷損傷模型，觀察BPS對鋁過負荷大鼠皮層損傷的作用，并通過其對大鼠皮層PGI2含量、PGIS和IP mRNA、IP蛋白表達的影響，初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 選取清潔級SD大鼠，♂，75只，200～250 g，飼養(yǎng)于SPF清潔環(huán)境中，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證書號：SCXK（渝）2012－0002。每組15只，隨機分為5組，即正常對照組、慢性鋁過負荷模型組、慢性鋁過負荷 ＋BPS 6μg·kg－1組、慢性鋁過負荷 ＋BPS 12μg·kg－1組、慢性鋁過負荷 ＋BPS 24μg·kg－1組。大鼠進行完水迷宮后，每組取3只用4%多聚甲醛進行在體腦組織固定后，迅速分離皮層組織，于多聚甲醛固定液中固定，待用；剩余實驗動物斷頭取腦，冰面上分離皮層組織，－80℃保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 貝前列素鈉（北京泰德制藥股份有限公司），SOD與MDA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），6-k-PGF1αELISA Kit、兔抗鼠IP一抗抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（Cayman公司，美國），PrimeScipt RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa公司），iQ SYBR＠Green預混液、定量PCR儀、凝膠成像圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），－80℃超低溫冰箱（SANYO公司，日本），DMS-2 Morris水迷宮（中國醫(yī)學科學院），全自動酶標儀（Spectra Max M2公司，美國），電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及藥物處理 慢性鋁過負荷模型組大鼠每天1次灌胃給予葡萄糖酸鋁（Al3＋200 mg·kg－1），每周5 d，連續(xù)20周，正常對照組給予葡萄糖酸鈉。BPS處理組在每次給予葡萄糖酸鋁2 h后，分別給予 6、12、24μg·kg－1BPS，正常對照組與鋁模型組給予等容積的羧甲基纖維素鈉［7］。

1.2.2 水迷宮實驗 停止給鋁的d 1，使用Morris水迷宮對大鼠空間學習記憶能力進行測定。測定主要由兩階段完成，第一階段為訓練階段：d 1先將大鼠放到平臺上適應60 s，再將其從平臺的4個象限依次面池壁入水，后讓其自由游泳尋找隱藏在水中的平臺，此步驟持續(xù)訓練4 d，每天4次。在4 d中，180 s內未能找到平臺的大鼠，實驗者將其引至平臺停留10 s，并將尋臺潛伏期記為180 s，每只大鼠每天4次的學習成績作平均值記為空間學習能力；第二階段即實驗進行的d 5，為大鼠學習能力的測試階段：將大鼠從最后1次入水位置面池壁放入水中，記錄大鼠的尋臺潛伏期（超過180 s的計為180 s），作為空間記憶能力的評判［8］。

1.2.3 組織病理學觀察 水迷宮實驗完成后，每組隨機挑選3只大鼠，4%水合氯醛腹腔注射將其麻醉，快速滴入100 ml預冷的肝素化磷酸緩沖溶液后，用4%的多聚甲醛200 ml進行在體灌注，斷頭取腦。迅速分離皮層組織，4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，做厚約4～5μm冠狀切面切片，HE染色，觀察皮層神經元形態(tài)結構變化［9］。

1.2.4 生化酶學檢測SOD活性和MDA含量 水迷宮實驗完成后，每組隨機挑選4只大鼠，分離大鼠皮層組織，－80℃保存。皮層組織用生理鹽水制成10 g·L－1的勻漿，根據說明書操作，分別測定SOD活性和MDA含量。

1.2.5 ELISA法測定6-k-PGF1α含量 由于 PGI2結構不穩(wěn)定，在體內易被代謝為6-k-PGF1α，因此，本實驗采用測定6-k-PGF1α含量來間接反映PGI2的含量變化。將上述大鼠皮層組織制成10 g·L－1的勻漿液，并于4℃、12 000×g離心10 min，收集組織上清液。根據說明書操作，測定并計算每個樣品中6-k-PGF1α含量。

1.2.6 qRT-PCR檢測大鼠皮層組織中PGIS和IP mRNA表達 水迷宮實驗完成后，每組隨機挑選4只大鼠，分離大鼠皮層組織，－80℃保存，進行PCR和Western blot實驗。所有引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列參照GenBank基因庫，PGIS引物上游序列為 5′-GCTACCTGACCCTGTATGGAGT-3′，下游序列為 5′-GTCTTTATCCCCCACTGACAAG-3′，擴增片段為158 bp，T＝57.9℃。IPmRNA引物上游序列為5′-CTGCTGGTGACCTCCATCTTCT-3′，下 游 序 列 為 5′-CTGCGTGAATCCTCTGATCGT-3′，擴增片段為 183 bp，T ＝ 62.3℃。GAPDH mRNA引物上游序列為 5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游序列為 5′-TTTGAGGGTGCACGAACTT-3′，擴增片段為 250 bp，T＝63.5℃。通過比較各組CT（初始循環(huán)數）的方法，按照2－ΔΔCT公式進行基因表達的相對定量分析［10］。其中，ΔCT＝CT（目的基因） －CT（內參基因），ΔΔCT＝ΔCT（實驗組）－ΔCT（對照組）。

1.2.7 Western blot檢測大鼠皮層組織中IP蛋白表達 組織裂解液提取大鼠皮層組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量。蛋白 ∶上樣緩沖液1∶4的比例混勻，100℃5 min煮沸變性，進行SDS-PAGE電泳；濕法轉至PVDF膜；5%的脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h；4℃ 過夜 孵 育 IP一抗 （1∶300）、β-actin（1∶1 000）；TBST洗膜，室溫搖床孵育辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000）1 h；TBST洗膜，ECL化學發(fā)光。Bio-Rad系統(tǒng)成像，IP蛋白的相對表達量用IP與β-actin的光密度比值進行計算。

1.2.8 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數據均用±s表示，組間比較采用方差分析及Dunnett′s t檢驗。

2 結果

2.1 BPS對慢性鋁過負荷大鼠空間學習記憶能力的影響 與正常對照組相比，鋁過負荷模型組大鼠尋臺潛伏期延長（P＜0.01）。給予BPS組縮短鋁過負荷大鼠尋臺潛伏期，且差異具有顯著性（P＜0.01）（Tab 1）。

2.2 BPS對慢性鋁過負荷大鼠皮層組織形態(tài)結構的影響 正常對照組大鼠皮層神經元細胞結構清晰，核膜完整，無明顯核固縮。鋁過負荷模型組大鼠皮層神經元細胞核膜界限不清，數目減少，胞體核固縮深染明顯。與鋁過負荷模型組相比，BPS給予組劑量依賴性地減輕大鼠皮層神經元損傷（Fig 1）。

2.3 BPS對慢性鋁過負荷大鼠皮層組織SOD活性和MDA含量變化的影響 與正常對照組相比，鋁過負荷模型組大鼠皮層 SOD活性降低（P＜0.01），MDA含量升高（P＜0.05）。與模型組相比，BPS組劑量依賴性地升高鋁過負荷大鼠皮層SOD活性（P＜0.01），明顯降低鋁過負荷大鼠皮層MDA含量（P＜0.01）（Tab 2）。

Tab 1 Effects of BPS on changes of spatial learning and memory ability of rat induced by chronic aluminum-overload（ˉx±s，n＝15）

Fig 1 Effects of BPS on changes of neuronal pathomorphology of rat cortex induced by chronic aluminum-overload（×400）A：Control group；B：Al-overload group；C：BPS 6μg·kg－1 group；D：BPS12μg·kg－1 group；E：BPS 24μg·kg－1 group

Tab 2 Effects of BPS on changes of SOD activities and MDA contents of rat cortex induced by chronic aluminum-overload（±s，n＝4）

Tab 2 Effects of BPS on changes of SOD activities and MDA contents of rat cortex induced by chronic aluminum-overload（±s，n＝4）

＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Al-overload group

Group SOD／kU·g－1 Pro MDA／μmol·g－1 Pro Control 17.75±1.79 1.12±0.34 Al-overload 9.34±2.12＃＃ 3.61±1.20＃BPS 6μg·kg－1 11.19±1.24 1.74±0.45*BPS12μg·kg－1 13.66±1.78* 1.36±0.24**BPS24μg·kg－1 15.15±1.19** 1.18±0.03**

2.4 BPS對慢性鋁過負荷大鼠皮層組織6-k-PGF1α含量的影響 與正常對照組相比，鋁過負荷模型組大鼠皮層6-k-PGF1α含量升高，且差異具有顯著性（P＜0.01）。與模型組相比，BPS組能明顯降低6-k-PGF1α含量（P＜0.05）（Tab 3）。

Tab 3 Effects of BPS on 6-k-PGF1αcontent of rat cortex induced by chronic aluminum-overload（±s，n＝4）

Tab 3 Effects of BPS on 6-k-PGF1αcontent of rat cortex induced by chronic aluminum-overload（±s，n＝4）

＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs Al-overload group

Group 6-k-PGF1α／ng·g－1tissue Control 6.10±1.54 Al-overload 10.68±1.28＃＃BPS6μg·kg－1 6.79±1.81*BPS 12μg·kg－1 7.91±1.24*BPS 24μg·kg－1 6.42±1.38*

2.5 BPS對慢性鋁過負荷大鼠皮層PGIS mRNA表達的影響 與正常對照組相比，鋁過負荷大鼠皮層PGISmRNA表達升高，且差異具有顯著性（P＜0.01）。BPS 6μg·kg－1組能降低鋁過負荷大鼠皮層PGISmRNA表達，但差異無顯著性；BPS 12、24 μg·kg－1組則能明顯降低鋁過負荷大鼠皮層PGIS mRNA的表達（P＜0.05）（Tab 4）。

Tab 4 Effects of BPSon changes of PGISmRNA expression of rat cortex induced by chronic aluminum-overload±s，n＝4）

Tab 4 Effects of BPSon changes of PGISmRNA expression of rat cortex induced by chronic aluminum-overload±s，n＝4）

＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs Al-overload group

Group The relative mRNA expression（PGIS／GAPDH）Control 1.00±0.00 Al-overload 2.58±0.51＃＃BPS 6μg·kg－1 2.22±0.19 BPS 12μg·kg－1 1.51±0.03*BPS24μg·kg－1 1.49±0.20*

2.6 BPS對慢性鋁過負荷大鼠皮層IP mRNA表達的影響 與正常對照組相比，鋁過負荷組大鼠皮層IP mRNA表達升高，且差異具有顯著性（P＜0.01）。BPS 6μg·kg－1組能降低鋁過負荷大鼠皮層IP mRNA表達，但差異無顯著性；BPS 12、24μg·kg－1組則能劑量依賴性地明顯降低鋁過負荷大鼠皮層IP mRNA的表達（P＜0.01）（Tab 5）。

Tab 5 Effects of BPS on changes of IP mRNA expression of rat cortex induced by chronic aluminum-overload（xˉ±s，n＝4）

Tab 5 Effects of BPS on changes of IP mRNA expression of rat cortex induced by chronic aluminum-overload（xˉ±s，n＝4）

＃＃P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs Al-overload group

Group The relative mRNA expression（IP／GAPDH）Control 1.00±0.00 Al-overload 2.31±0.16＃＃BPS 6μg·kg－1 1.96±0.12 BPS 12μg·kg－1 1.69±0.04**BPS24μg·kg－1 1.15±0.12**

2.7 BPS對慢性鋁過負荷大鼠皮層IP蛋白表達的影響 與正常對照組相比，鋁過負荷組大鼠皮層IP蛋白表達升高，且差異具有顯著性（P＜0.05）。BPS 6μg·kg－1組能降低鋁過負荷大鼠皮層IP蛋白表達，但差異無顯著性；BPS 12、24μg·kg－1組則能劑量依賴性地明顯降低鋁過負荷大鼠皮層IP蛋白的表達（P＜0.05）（Fig 2）。

Fig 2 Effects of BPS on changes of IP protein expression of rat cortex induced by chronic aluminum-overload±s，n＝4）1：Control group；2：Al-overload group；3：BPS 6μg·kg－1 group；4：BPS 12μg·kg－1 group；5：BPS24μg·kg－1 group.＃P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs Al-overload group

3 討論

鋁作為一種重要的神經毒素，在體內和體外實驗中均得到了廣泛研究，主要與認知功能障礙和各種精神疾病相關。Yu等［11］在大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，長期鋁暴露不僅會導致神經功能紊亂，而且海馬神經元中Al、Fe、Cu等金屬離子失衡，發(fā)生一系列的生化改變。因此，本實驗采用葡萄糖酸鋁建立慢性鋁過負荷大鼠腦損傷模型。研究結果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，鋁過負荷模型組大鼠空間學習記憶能力降低，皮層神經元核固縮，SOD活性降低，MDA含量增加，6-k-PGF1α的含量升高的同時，皮層 PGIS、IP mRNA表達及IP蛋白表達也增加。Kumar等［12］通過灌胃給予大鼠三氯化鋁6周，發(fā)現(xiàn)大鼠的認知功能發(fā)生障礙。Fang等［13］對局部腦缺血／再灌注損傷大鼠進行了研究，發(fā)現(xiàn)大鼠皮層 PGI2含量、PGIS mRNA和蛋白表達均增加，本實驗也發(fā)現(xiàn)同樣的變化。COX-2是介導炎癥反應的關鍵酶，在炎癥因子和有絲分裂原刺激下，催化產生PGs，PGs又與慢性炎癥相關。我們的前期研究結果發(fā)現(xiàn)，慢性鋁過負荷大鼠COX-2 mRNA和蛋白表達明顯升高［14］。Yu等［11］在慢性鋁過負荷大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，鋁負荷引起腦中Fe、Cu、Zn等金屬離子含量明顯升高。Elseweidy等［15］提出，腦內過多的Fe可通過與H2O2結合，產生OH－、O－2、ROS等活性氧而損傷細胞。鋁過負荷可能導致鋁、鐵等金屬離子增加，通過芬頓反應導致明顯的氧化應激損傷，而氧化應激損傷又啟動了細胞膜磷脂－花生四烯酸-COX-2的過度激活，反過來加重了神經損傷，最后導致了PGIS表達增加、PGI2含量增加，而IP受體不下調反而上調的平衡失調，最終導致了中樞神經系統(tǒng)明顯的損傷。

我們實驗結果還發(fā)現(xiàn)，BPS能明顯縮短鋁過負荷大鼠的尋臺潛伏期，改善其空間學習記憶能力，升高SOD活性，降低MDA含量。同時，BPS也明顯降低大鼠皮層6-k-PGF1α含量及下調 PGIS、IP mRNA和IP蛋白的表達。結果提示，BPS對慢性鋁過負荷大鼠皮層損傷有明顯保護作用。PGI2主要通過IP受體發(fā)揮作用，IP被激活后偶聯(lián)Gs和Gq蛋白，升高環(huán)磷腺苷（cAMP）和磷酸肌醇（IP3）濃度，抑制Ca2＋流入，發(fā)揮各種保護作用。BPS通過刺激生長相關蛋白43（growth associated protein 43，GAP-43）的表達促進慢性缺血性腦病神經元的修復和再生，進而起到腦保護作用［16］。另有研究報道，BPS通過重建PGIS-IP信號通路平衡，對GCIR損傷具有腦保護作用［6］。Bentzer等［17］連續(xù)（48 h）靜脈滴注低劑量的 PGI2（1 ng·kg－1·min－1），可減輕創(chuàng)傷性大鼠皮層損傷。另有研究表明，腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）可通過激活花生四烯酸而促進PGI2的生成［18］，這有利于通過增強血管擴張能力和減弱血管收縮刺激來恢復腦動脈壁活力。這些研究提示，PGI2／PGI2類似物在腦損傷中發(fā)揮著至關重要的作用。在本實驗中，給予BPS后通過激動IP受體發(fā)揮其腦保護作用，打破了鋁過負荷導致的惡性損傷循環(huán)，大鼠皮層COX-2等炎癥相關酶表達下調，PGI2含量、PGISmRNA表達下調。又由于BPS為外源性IP受體激動劑，長期使用BPS，通過受體調節(jié)機制使得IP受體數量反射性下調，IP mRNA和蛋白表達下調。

綜上所述，BPS可能通過下調PGIS mRNA表達、降低PGI2含量、下調IP mRNA和蛋白的表達，重建PGIS-IP信號通路平衡，從而產生對大鼠皮層損傷的保護作用，但是，其對受體后信號轉導的影響需要進一步的研究證實。

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